La eficacia biológica es determinante en evolución, conservación y también en el área biosanitaria. Las mutaciones pueden tener un efecto distinto sobre eficacia biológica: ventajosas, deletéreas [...]]]> La mutación espontánea es la fuente última de variabilidad genética responsable de la evolución. Los caracteres cuantitativos se pueden clasificar como:

• Morfológicos
• Eficacia biológica
• Componentes de la eficacia

La eficacia biológica es determinante en evolución, conservación y también en el área biosanitaria. Las mutaciones pueden tener un efecto distinto sobre eficacia biológica: ventajosas, deletéreas o neutras. A nivel poblacional, el que una mutación tenga efecto deletéreo grande o pequeño va a depender del tamaño poblacional; más concretamente, del censo efectivo (Ne). Así, hay ciertas mutaciones que en la población grande estaban sentenciadas a ser eliminadas, mientras que en una población pequeña tienden a fijarse por deriva. Cuando aparece una mutación en la población, sobre ella actúan dos fuerzas: la deriva y la selección. La importancia de cada una está en función del producto N x S. Cuando N x S = 1 la deriva y la selección actúan sobre las mutaciones con igual importancia.

Para evaluar el efecto de las mutaciones espontáneas sobre caracteres cuantitativos se usan experimentos de acumulación de mutaciones. Se utilizan poblaciones sin variabilidad genética, así con el tiempo la variabilidad genética aparecida se podrá asociar con la mutación. Además las poblaciones deben ser de tamaño pequeño, entonces habrá mucha deriva y poca selección. Por ejemplo, en Drosophila se mantienen líneas hermano x hermana, donde las mutaciones deletéreas se acumulan por azar. Al final del proceso habrá variabilidad genética entre líneas, la eficacia media será menor (por acumulación de mutaciones deletéreas), la varianza será mayor y la distribución será asimétrica. Para determinar la tasa de mutación deletérea (lambda) se pueden realizar estimas de Bateman-Mukai. Mediante distintos experimentos se ha establecido que los organismos con ciclo generacional corto y pocos individuos por generación poseen un efecto deletéreo pequeño y una tasa de mutación deletérea del orden de 2-3%. Por otro lado, el grado medio de dominancia (h) se reduce al aumentar el efecto deletéreo. A largo plazo las mutaciones deletéreas se pierden, ya que al ser recesivas la selección natural solo las detecta en homocigosis, y pueden segregar mucho tiempo en la población.

Las mutaciones de efecto pequeño no se detectan por el método de acumulación de mutaciones. Para ello, se usan experimentos de evolución molecular. Permiten comparar la tasa de evolución entre dos linajes y estudiar las diferencias genéticas entre ambos. También se puede inferir la tasa de sustitución. Existen otros métodos que estiman la distribución de NeS a partir de datos moleculares, pero están influidos por el grado de dominancia y la historia demográfica. Es importante destacar que algunas mutaciones no codificantes pueden ser deletéreas. También existen otros efectos mutacionales como pequeños indel o transposones.

Distintas teorías apoyan que las mutaciones deletéreas son responsables de la evolución de la reproducción sexual anisogamia. Se dice que la reproducción sexual anisogámica tiene un coste evolutivo doble. Además dicho tipo de reproducción contribuye a la eliminación de mutaciones deletéreas. Existen teorías como:

- Trinquete de Muller: Población pequeña y aparecen mutaciones. Solo hay individuos con 1, 2, 3 o 4 mutaciones, pero no hay individuos sin mutación. Como no existe sexo ni recombinación, todos los descendientes tendrán al menos una mutación deletérea. En estas circunstancias el genoma con menos mutaciones establece la pauta en las siguientes generaciones.

- Teoría determinista de la evolución del sexo: Población grande. El sexo y la recombinación permiten que aparezcan gametos con mayor o menor número de mutaciones deletéreas. Con bajo coste elimina muchas mutaciones deletéreas. Los gametos con gran cantidad de mutaciones deletéreas no se reproducen.

Sobre caracteres morfológicos también se puede estudiar el efecto de la mutación espontánea. La mayoría de las mutaciones disminuyen la expresión del carácter. Con la información obtenida se puede predecir la tasa de depresión consanguínea y el deterioro de la eficacia media en el equilibrio. Además se podrían hacer predicciones sobre componentes de la variabilidad genética y de la eficacia.

Por lo tanto, el efecto de la mayoría de las mutaciones solo se puede evaluar de forma indirecta (excepto para mutaciones de efecto grande). A partir de experimentos de acumulación de mutaciones puede estimarse la distribución de los efectos. Los estudios de evolución molecular proporcionan información adicional. Es importante destacar que las mutaciones más deletéreas (en promedio) tienden a ser más recesivas. La varianza mutacional para caracteres cuantitativos es similar a 10^-3 y se debe, en buena parte, a mutaciones de efecto pequeño. Además se comportan como si fuesen responsables de la varianza genética de esos caracteres.

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Existen dos grupos de genes, los que señalizan el daño en el DNA y los que reparan el daño. Las mutaciones en estos genes dan lugar a síndromes hereditarios como el cáncer de colon hereditario sin poliposis o la Ataxia telangiectasia. Las respuestas celulares al daño en el [...]]]> Principales mecanismos de reparación del DNA

Existen dos grupos de genes, los que señalizan el daño en el DNA y los que reparan el daño. Las mutaciones en estos genes dan lugar a síndromes hereditarios como el cáncer de colon hereditario sin poliposis o la Ataxia telangiectasia. Las respuestas celulares al daño en el DNA se pueden resumir en la siguiente tabla:

Fotorreactivación enzimática

La exposición a la luz UV da lugar a la formación de dímeros de timina (T) en el DNA. Para reparar este daño existen enzimas como la fotoliasa, posee dos sitios activos (antena y centro catalítico). Su mecanismo de acción se basa en la transferencia de un electrón al dímero de T. Existen tres grupos de fotoliasas: clase I, II y fotoliasas 6-4 (reconocen dímeros de pirimidina 6-4).

Reparación de alquilaciones

Las bacterias poseen un mecanismo a través del cual se vuelven resistentes a agentes alquilantes. Esta adaptación es posible gracias a la proteína Ada, es una metiltransferasa. En condiciones normales, existen niveles basales de proteínas implicadas en reparación del DNA (ada, alkA, alkB y aidB). En presencia de agentes alquilantes en baja concentración, se produce metilación pero a bajo nivel. La proteína Ada metilada actúa como factor de transcripción, activando la expresión de los genes anteriores.

Reparación por escisión de bases (BER)

Las bases alteradas son reconocidas de forma específica por glicosilasas y eliminadas, generando un sitio AP. El hueco se rellena mediante una DNA polimerasa que toma como molde la hebra sana. Este sistema surge no solo por la exposición a agentes externos, también por la propia actividad de la célula.

Reparación por escisión de nucleótidos (NER)

La zona dañada es reconocida por UvrA y B, después A y B se separan y entra UvrC que forma con B un complejo con actividad endonucleasa. Esta enzima corta el dímero de T y el hueco es rellenado por una DNA polimerasa. También existe el sistema TC-NER (sistema de reparación de nucleótidos acoplado a transcripción). La alteración de estos mecanismos da lugar a enfermedades como: Xeroderma pigmentosum, Tricotiodistrofia o Síndrome de Cockayne.

Reparación del falso apareamiento

Se da un falso apareamiento que es reparado por el siguiente mecanismo: MUTS y L se unen a la región dañada. Posteriormente MUTH corta la hélice dañada, reconocida por metilaciones específicas introducidas por la proteína dam. En Eucariotas existen homólogos a los genes que codifican para estas proteínas; excepto para MUTH. Además el proceso es mucho más complejo.

Tolerancia al daño

Existe una polimerasa especial que puede llevar a cabo la síntesis translesiva, puede polimerizar sin necesidad de molde. Depende de los genes: LexA, umuDC, RecA y uvrA. En condiciones normales LexA inhibe la expresión de estos genes. Cuando hay daño en el DNA la proteína RecA se activa y bloquea la acción de LexA. Además RecA actúa sobre umuD, dando lugar a umuD´ que forma, junto con umuC, la polimerasa translesiva. Este método impide que la célula muera, pero introduce un elevado número de mutaciones.

Proteína PARP

La exposición de las células eucarióticas a agentes mutágenos da lugar a roturas en el DNA. Entonces se produce una reacción de estrés y se activa la proteína PARP (Poli (ADP-ribosa) polimerasa). Esta proteína se une a las roturas de las hebras y se sintetizan polímeros de vida corta. Se caracteriza por ser transitoria, preceder a la reparación del DNA y a la inducción de p53. En levaduras no hay PARP. Los polímeros son degradaos por la proteína glucohidrolasa.

La proteína PARP está en los núcleos, en alto número de copias y distribuida por todo el genoma. En humanos existen dos genes: PARP1 y PARP2. PARP1 presenta tres dominios: de unión al DNA, de automodificación y de función polimerasa. Las funciones de PARP son:

- Reclutamiento de los factores de reparación del DNA.

- Señalización del daño.

- Relajación de la estructura de la cromatina.

Existen inhibidores de PARP como los análogos estructurales de nicotinamida.

Estudios funcionales:

- Sobreexpresión de DBD (dominio de unión al DNA) en fibroblastos.

El dominio DBD actúa como represor al unirse al DNA dañado, ya que se establece una competencia con las proteínas PARP funcionales. No hay polímeros ni reparación del DNA. Se da hipersensibilidad a agentes alquilantes y radiaciones ionizantes; además de inestabilidad genómica.

- Sistemas acelulares.

Se usaron extractos de células humanas a los que se añadió un plásmido tratado con radiación ?. Mediante estos estudios se vio que la reparación es dependiente de NAD, en presencia de PARP. En ausencia de PARP es independiente.

- Ratones knockout PARP.

Son ratones transgénicos, sin proteína PARP (PARP -/-). Se observó que en estos ratones hay mayor número de intercambios entre cromátidas hermanas, por lo tanto, presentan mayor inestabilidad genómica.

- Desarrollo de linfocitos.

Los linfocitos presentan receptores antigénicos, formados por recombinación VDJ. Este proceso permite obtener gran diversidad de receptores. Se han conseguido ratones SCID (deprimidos inmunológicamente) y PARP-/- . En este caso, hay cierto grado de recombinación y se forman algunos receptores VDJ.

- Relación de PARP con NO (óxido nítrico) y muerte celular.

El NO a dosis elevadas es tóxico, se relaciona con isquemia cerebral y daño en el DNA. Entonces se induce la actividad de PARP. Se hicieron experimentos a partir de extractos de núcleos de cerebro de rata. Se introduce DNA incubado con NO e inhibidores de PARP, y se evalúa la muerte celular. Se observó que la ausencia de actividad de PARP favorece la viabilidad celular. Esto es debido a que si el DNA está machacado PARP se asocia a distintos puntos, el NAD se agota y la célula muere por necrosis.

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Los elementos móviles son secuencias discretas de DNA que pueden cambiar de posición en el genoma de un organismo. Fueron descubiertos en maíz en 1951 por Bárbara McClintock. En función del mecanismo de transposición se clasifican en: clase I (copiar y pegar, aumento en el número de copias) y clase II (cortar y [...]]]>

Los elementos móviles son secuencias discretas de DNA que pueden cambiar de posición en el genoma de un organismo. Fueron descubiertos en maíz en 1951 por Bárbara McClintock. En función del mecanismo de transposición se clasifican en: clase I (copiar y pegar, aumento en el número de copias) y clase II (cortar y pegar, no aumenta el número de copias).

Clase I ? Existen tres grupos: LTR Retrotransposones (Ty 1 copia group-Saccharomyces y Ty 3 gypsy group-Drosophila), no LTR Retrotransposones (LINE y SINE) y Pseudogenes procesados. Se caracterizan por presentar transcripción replicativa y vía RNA, producir mutaciones estables, estar en elevado número de copias, ser raramente activos, poseer repeticiones directas y además pueden ser autónomos o no autónomos. Dentro de la clase I existen otros elementos con características distintas: DIRS y PLE.

Clase II ? Subclase I: Tyr (hAT, P, CACTA…etc) y Crypton. Subclase II: Helitrones y Maverick. Se caracterizan por: presentar transcripción replicativa y no replicativa, no requerir molécula intermedia, bajo número de copias (excepto MITE), presentar TIR, provocar mutaciones inestables, también pueden ser autónomos o no autónomos.

Los transposones forman una parte importante del genoma, pero su contenido y tipo varía entre especies. También la actividad varía entre especies. Así, en maíz, Drosophila y C.elegans existen muchas familias de transposones activos. Los elementos L1 son igual de abundantes en humanos y ratón, pero son 30 veces más activos en ratón. En especies con mayor número de copias, dichas copias presentan un efecto menor sobre la tasa de mutación. No se sabe si forman parte del DNA basura o si por el contrario poseen alguna función (hipótesis más aceptada en la actualidad). Es importante destacar que intervienen en la organización y estructuración de los genomas eucariotas.

Son agentes mutágenos y mediante recombinación se pueden dar reordenamientos cromosómicos. Su expansión puede aumentar el tamaño del genoma y su inserción en regiones reguladoras puede provocar cambios en la expresión génica. Además, al pasar de una región a otra pueden originar puntos de homología. Existen reordenamientos en los que se ha demostrado recombinación mediada por transposones: inversiones en Drosophila buzzatii. Además, analizando las LTR se puede estimar la edad del retrotransposón y su relación con la tasa de mutación.

Existen estudios en los que se ha demostrado la implicación de los transposones en expresión génica. Este efecto puede producirse porque el transposón lleve señales o porque genere modificaciones epigenéticas que originen cambios en la expresión. En ratón se vio que había diferencias en la expresión de un gen asociado con la coloración del pelo. Dependiendo de la proximidad del transposón al gen se producían dichas diferencias. Los elementos LINE y SINE están relacionados con el splicing alternativo. Los elementos móviles poseen también otras funciones estructurales: constituyen las regiones centroméricas de casi todas las especies y además, se han asociado con el mantenimiento de los telómeros en ciertas especies como Drosophila. Por otro lado, las recombinasas RAC-1 y RAC-2 parecen derivar de transposones.

Los genomas han desarrollado mecanismos epigenéticos de defensa frente a los transposones:

• Silenciamiento postranscripcional por RNAi (RNA de interferencia).
• Modificaciones de la cromatina (silenciamiento transcripcional) ? son modificaciones de histonas y metilación del DNA.

Sin embargo, algunos de los elementos móviles permanecen activos. Además los factores ambientales pueden actuar sobre los cambios epigenéticos, implicando movimiento de transposones.

Los transposones constituyen una herramienta para realizar mutagénesis por inserción. Para ello, se requiere un mapa saturado de mutaciones. Es de fácil detección. Existen dos métodos fundamentales:

• Transposición insercional.
• T-DNA.

Por ejemplo, se usan mucho los elementos P de Drosophila melanogaster. No se insertan al azar, si no en regiones reguladoras: 5´UTR, 3´UTR o en el promotor. Por ello se usan para hacer Gene Trap o Enhancer Trap.

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Con el programa MAPMAKER se pueden determinar los grupos de ligamiento mediante un análisis de dos puntos. Posteriormente se llevará a cabo la ordenación de loci. Para ello se van dando una serie de instrucciones al programa:

1> prepare data cromo3.raw o pd cromo3.raw. Sirve para cargar el archivo de datos, en [...]]]>

Con el programa MAPMAKER se pueden determinar los grupos de ligamiento mediante un análisis de dos puntos. Posteriormente se llevará a cabo la ordenación de loci. Para ello se van dando una serie de instrucciones al programa:

1> prepare data cromo3.raw o pd cromo3.raw. Sirve para cargar el archivo de datos, en este caso el archivo es cromo3.raw.

2> Photo tutorial.out. Para almacenar los resultados.

3> sequence all o s all. De esta forma se dice al programa que se quieren analizar todos los loci. También se pueden analizar solo ciertos loci introduciendo s 1 2 3 4, por ejemplo.

4> Group o gr. Con esta instrucción MAPMAKER detecta los grupos de ligamiento. Considera que dos loci están ligados cuando el valor de LOD es igual o superior a 3 y la distancia máxima es de 50 cM. En este caso, se obtuvo un solo grupo de ligamiento:

Group1 = 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

5> sequence {1 2 3 4 5 6 7 8} o s {1 2 3 4 5 6 7 8}. Para que ordene los loci señalados.

6> compare. Determina los posibles órdenes o mapas por el método de máxima verosimilitud y los ordena de más a menos probable. El programa muestra los 20 mejores; de los cuales el mejor orden es:

1 2 3 4 5 6 7 8

7> s 1 2 3 4 5 6 7 8 o s order1. A través de esta instrucción seleccionamos el mejor orden para obtener, posteriormente, las distancias entre los loci.

8> map. Para la obtención del mapa. El resultado es:

9> try 9 10. Así se pueden introducir los loci 9 y 10 en el mapa construido previamente. Se obtiene como resultado que dichos loci están después del locus 8. Pero no se sabe cual va primero, si el locus 9 o el 10. Por ello, se colocará primero el locus 10:

10> s 1 2 3 4 5 6 7 8

11> try 10. Se obtiene que el locus 10 está después del locus 8.

12> s 1 2 3 4 5 6 7 8 10. Se introduce el orden con el locus 10.

13> try 9. Se observa que el locus 9 está entre el 8 y el 10.

14> s 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

15> try 12

16> s 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12

17> try 11

18> s 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

19> try 15

20> s 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 15

21> try 13

22> s 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 15

23> try 14

24> s 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

25> try 17

26> s 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 17

27> try 16 18

28> s 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18. Una vez que se tiene el orden de todos los loci se construye el mapa:

29> map. El resultado es:

¨ Construcción de mapa genético del cromosoma tres de Arabidopsis Thaliana utilizando el programa JOINMAP

Se abre el programa JOINMAP y en File ? New proyect, se guarda el archivo como cromo3.jmp. Posteriormente, se cargan los datos con load data, se busca el archivo cromo3.raw.

El tipo de población es RI10 (F1), el número de loci es 18 y hay 162 individuos (Figura 1).

JoinMap 3.0 Tue, 10 Feb 2009, 22:04

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locus genotype file: C:Documents and SettingsAdministratorDesktopDOCTORADOHERRAMIENTAS INFORMAT. DE APLICACION EN GENÉTICA Y BIOLOG.CELULProgramas de MapasMAPMAKERcromo3.raw

population name: cromo3

population type: RI10

nr. of loci: 18

nr. of individuals: 162

final number of individuals: 162

Figura 1. Información general.

En “Locus genot. freq.” se le da a calcular, aparecen 11 loci con asterisco, lo que significa que no segregan bien; no se ajusta a una segregación 1:1 (Figura 2). Estos loci habría que eliminarlos, otro motivo para la eliminación de loci sería que los distintos marcadores no se encontraran en un número elevado de individuos. En este caso, el locus 9 no se analizó en 5 individuos lo que no es muy significativo, teniendo en cuenta que hay 162. En principio no se eliminará ningún loci para hacer el análisis.

Figura 2. Frecuencias genotípicas de los loci.

En “Individual genot. freq.” (Figura 3) se observa que no hay individuos en los que estén ausentes un número elevado de marcadores, por lo que no hay que eliminar ningún individuo. En este apartado también se determina el porcentaje de homocigotos de tipo “a” y “b” y de heterocigotos (en este caso no hay heterocigotos para ningún marcador). Así, por ejemplo, para el locus 5 hay 18 individuos homocigotos de tipo “a”, para el locus 3 hay 8 de tipo “a”, 9 de tipo “b” y 1 individuo en el que no se detectó dicho marcador.

Figura 3. Frecuencias genotípicas de los individuos.

Además se analizó la similitud entre loci (figura 4), observándose que el locus 17 y el 18 son muy semejantes, con similitud del 96%. Por otro lado, se calculó la similitud entre individuos siendo igual a 1 en todos los casos (figura 5).

Figura 4. Similitud entre loci.

Figura 5. Similitud entre individuos.

Para determinar los grupos de ligamiento, se da a calcular en “LOD groupings”. Como muestra la figura 6 existe un solo grupo de ligamiento, con valores de Lodscore entre 3 y 10. Este grupo de ligamiento está constituido por los 18 loci.

Figura 6. Grupos de ligamiento existentes en el cromosoma 3 de Arabidopsis Thaliana.

Los grupos de ligamiento también se pueden representar en forma de árbol:

Figura 7. Grupos de ligamiento existentes en el cromosoma 3 de Arabidopsis Thaliana.

Con el programa Joinmap se pueden determinar los ligamientos débiles, fuertes y sospechosos. Los ligamientos débiles son aquellos en los que el valor de la fracción de recombinación (r) es mayor que 0.45 o el valor de LOD es menor que 0.05, mientras que los fuertes poseen un valor de “r” inferior a 0.010 o LOD superior a 10.0. Los ligamientos sospechosos se dan cuando “r” vale más de 0.6. En este caso, existen ligamientos fuertes y débiles (figura pero no sospechosos. En este caso, se consideró ligamiento máximo cuando el valor de LOD es superior a 20.77.

Ligamientos débiles Ligamientos fuertes

Figura 8. Ligamientos débiles y fuertes.

Posteriormente se obtuvo el mapa (figura 9), los números de la izquierda son las distancias genéticas referidas al primer marcador.

Figura 9. Mapa genético

En Map text se observan los 18 loci del grupo 1 y sus distancias genéticas, también referidas al primer marcador:

Figura 10. Distancias genéticas.

En la figura 11 se observa el cálculo de las frecuencias genotípicas de los loci. Ciertos loci no segregan bien, y aparecen en la tabla con un asterisco.

Figura 11. Frecuencias genotípicas de los loci

Si eliminamos los loci con asterisco, entonces se obtiene que no hay ligamientos débiles ni sospechosos solo fuertes. El mapa y las frecuencias genotípicas de cada locus se muestran en la figura 12.

Figura 12. Mapa genético y frecuencias genotípicas de los loci

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Primero se descubrió en insectos, donde se vio que ciertos cromosomas o juegos cromosómicos completos se perdían y no se transmitían a la siguiente [...]]]> El imprinting es una modificación química estable del DNA que implica la formación de alelos no funcionales. Se hereda de forma clonal y su transmisión es distinta según el sexo.

Primero se descubrió en insectos, donde se vio que ciertos cromosomas o juegos cromosómicos completos se perdían y no se transmitían a la siguiente generación. Los estudios en Cóccidos revelaron que la pérdida del genoma paterno puede ocurrir en distintas etapas del desarrollo. En sciáridos se parte de un cigoto con tres parejas de autosomas, tres cromosomas X y una serie de cromosomas llamados cromosomas L, que se pueden perder durante la división celular. En función del sexo se pierden unos u otros cromosomas.

Sin embargo, el estudio del imprinting se ha centrado en mamíferos y angiospermas. En este caso, los genomas masculino y femenino contribuyen por igual a la formación del cigoto, pero tienen efectos fenotípicos distintos. Esto es debido a que ciertos genes se transmiten de forma silente. En mamíferos se conocen 83 genes troquelados. La mayoría son autosómicos y los RNAs correspondientes se transcriben en el genoma materno o en el paterno, pero no en los dos. Los primeros experimentos se realizaron en ratón mediante el transplante nuclear (1984):

- Embriones 2n androgenéticos Mayor desarrollo de la placenta y menor el del embrión.

- Embriones 2n ginogenéticos Menor desarrollo de la placenta y mayor el del embrión.

Lo mismo se encontró en embriones triploides humanos. A través de otros estudios se pudo determinar la función de los genes troquelados, están implicados en el crecimiento fetal y posparto y también se relacionan con caracteres del comportamiento.

En ratón se realizaron estudios basados en la complementación de gametos. Se cruzaba un macho heterocigoto para una translocación con una hembra heterocigota para la misma translocación. Entonces se forman gametos desequilibrados, pero complementarios al fusionarse. Se obtienen individuos disómicos uniparentales (dos copias del mismo gen procedentes del mismo parental). En ratón se conocen unos 80 genes y 29 coinciden con genes humanos. La mayoría implicados en el desarrollo embrionario. Algunos no codifican proteínas sino RNAs implicados en el mecanismo de imprinting. Además están agrupados en los cromosomas, suelen tener replicación asincrónica y regulación espacio-temporal. Estos grupos de genes presentan con frecuencia secuencias de control: ICRs (secuencias troqueladas de control en cis). Mediante la técnica de complementación se definen las regiones y después se buscan los genes, para ello existen distintos métodos como: mutagénesis, microarrays, búsqueda de genes homólogos, rastreo de RNAs no codificantes…etc. Así se identificaron diferentes genes troquelados como Igf2 (factor de crecimiento fetal) y Mash-2 (factor de transcripción hélice-lazo-hélice).

La marca epigenética debe establecerse en los gametos y ser estable en todos los tejidos donde debe ser reconocida. Además tiene que poder ser borrada y reestablecida.

El ciclo del imprinting consiste en: se parte de un óvulo y un espermatozoide que tienen unas marcas gaméticas de metilación que son específicas. Primero tiene lugar una oleada de demetilación, pero las marcas de imprinting no desaparecen. Después se vuelve a marcar (remetilación) y se marca como óvulo o como espermatozoide. La metilación se caracteriza por:

- Estar catalizada por la familia de DNA metiltransferasas, principalmente hemimetilasas como Dnmt1.

- Su distribución es muy variable.

- Es importante para regular la expresión génica y no toda está relacionada con el imprinting.

- A veces el alelo silente es el metilado y otras el activo.

Es importante destacar que en casi todos los genes troquelados o cerca se han encontrado zonas susceptibles de metilación. Para estudiar la metilación en el tiempo se usaron anticuerpos anti 5-metilcitosina en embriones. Se vio que en el oocito el grado de metilación es muy bajo, mientras que en el espermatozoide es muy elevado. En embriones de 3 horas el marcaje es igual en cromosomas masculinos y femeninos, justo después de la fecundación los cromosomas maternos se metilan rápidamente. La demetilación de los cromosomas femeninos tiene lugar en la 3ª-4ª división y es de forma gradual. Los cromosomas paternos parten de un estado metilado, después se descondensan y pierden la metilación. En la línea germinal se tienen que borrar las marcas y establecerse como óvulo o como espermatozoide.

Se han realizado muchos estudios para determinar como se establece la metilación diferencial. Se podría explicar por la distinta estructura de la cromatina en el óvulo y el espermatozoide, además existen distintas proteínas asociadas y también un papel diferencial de los RNAs no codificantes. Se ha visto que existe una proteína CTCF, que se une al alelo materno no metilado en células somáticas, entonces no se puede metilar. Así existe una expresión alternativa. En otros casos existe la influencia de secuencias repetidas, lugares de reclutamiento de proteínas o transcripción transitoria de RNAs.

Además distintas proteínas contribuyen al mantenimiento del estado de metilación. Así, proteínas del complejo polycomb (EZH2, Eed…etc) de Drosophila interaccionan con DNA metiltransferasas para el mantenimiento de la metilación de histonas (Lys 27 H3). Después nuevas proteínas se unen al DNA metilado, reforzando el silenciamiento. Ej: deacetilación de histonas. Hay una relación entre la acetilación de histonas y la expresión génica:

- Histonas acetiladas ? Transcripción.

- Histonas deacetiladas ? Silenciamiento.

La metilación puede producir silenciamiento génico. A veces los alelos están metilados en el promotor implicando silenciamiento, pero también se puede dar una regulación coordinada. Existen distintos modelos:

1. Competición de Enhancers. Regulación en grupo. Igf2 y H19 imprinting recíproco.

2. Barreras cromatínicas. La formación de un lazo puede impedir que el promotor y el enhancer interaccionen. Ej: 5´ de H19.

3. RNA antisentido: interferencia transcripcional. Ej: Tsix, Igf2r, UBE3A.

4. RNA antisentido: interferencia postranscripcional.

5. Conformación de la cromatina.

El fenómeno de imprinting se ha asociado con ciertas enfermedades:

- Síndrome de Prader-Willi.

- Síndrome de Angelman.

Implican un defecto de la zona troquelada del cromosoma 15. Se puede deber a deleciones o a disomía uniparental. Normalmente son microdeleciones. También existen otras enfermedades humanas relacionadas con el imprinting como el autismo, esquizofrenia, trastorno bipolar, alcoholismo…etc. Además la alteración de genes troquelados puede dar lugar a la aparición de cáncer. Se puede producir aumento de la expresión de un proto-oncogén o perder la funcionalidad de genes supresores de tumores. Determinados procesos relacionados con reproducción asistida pueden alterar el imprinting, implicando graves consecuencias para el embrión. Ej: superovulación, criopreservación y maduración in Vitro.

El cromosoma X supone un caso especial. En Marsupiales se inactiva el Xp, en Euterios el Xp se inactiva en tejidos extraembrionarios. Existen genes que escapan a la inactivación. Además hay un centro de inactivación Xic. En los oocitos de los Euterios el cromosoma X está activo, pero en el espermatozoide está preinactivado. En el cigoto y en el embrión temprano, existe un X activo y un X inactivo, así se transmite a la placenta y a los tejidos extraembrionarios. En el blastocisto y en los distintos tejidos derivados del embrión, se produce una reactivación al azar. Xist lleva a cabo la inactivación.

Las posibles funciones del imprinting son:

- Remanente del sistema de defensa contra el DNA parásito (transposones).

- Evitar la partenogénesis.

- Reducir el “ruido transcripcional” en genomas complejos.

- Conflicto parenteral. Es la teoría más aceptada, se da en mamíferos y angiospermas. En la mayoría de los genes troquelados los alelos activos son los paternos y los inactivos son los maternos. Este conflicto es más acusado en los casos de poliandria y en sociedades matrilineales.

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• Mecanismos de reparación del DNA
• Epigenética e inmunosupresión/inmunosenescencia

La característica más evidente del mundo biológico es la diversidad. Existen especies muy diferentes, algunas altamente especializadas y otras muy generalistas. Además el código genético hace que cada individuo sea único. La diversidad es una respuesta adaptativa de la materia viva a los distintos ambientes y a sus múltiples formas de explotación. Es [...]]]> INTRODUCCIÓN

La característica más evidente del mundo biológico es la diversidad. Existen especies muy diferentes, algunas altamente especializadas y otras muy generalistas. Además el código genético hace que cada individuo sea único. La diversidad es una respuesta adaptativa de la materia viva a los distintos ambientes y a sus múltiples formas de explotación. Es importante destacar que toda la diversidad y variabilidad es producto de la evolución.

La evolución se produce por dos fases imprescindibles:

1. Producción de variantes.

2. Reproducción diferencial de esas variantes.

ORIGEN DE LA VIDA

Se calcula que hace 3,5 millones de años surgieron las primeras moléculas autorreplicativas (RNA). Existen distintas hipótesis sobre el origen de la vida:

§ Un “creador”.

§ Origen espontáneo.

§ En algún lugar del universo y fue transportada.

§ De la materia, de sustancias químicas.

El origen de la vida se debió producir por un fenómeno complejo pero ordenado. Parece que la selección natural actuó directamente sobre las moléculas iniciales. La formación de moléculas más elaboradas no fue al azar, existían ciertas características: una órbita casi circular, radiación, agua, gases…etc. A lo largo del tiempo se han realizado experimentos generado distintas hipótesis:

o Miller (1953): creó moléculas complejas a partir de sustancias que había en la tierra.

o Fox (finales de los 50): propuso que las proteínas son las primeras moléculas autorreplicativas.

o Cech & Altman (principios de los 80): ciertos tipos de RNA se comportan como enzimas (mundo RNA).

o Rebeck (1990): sintetizó moléculas sencillas con capacidad autorreplicativa: ETAA. Problemas: condiciones de laboratorio y excesiva fidelidad.

o Corliss: propone que la vida surgió en los fondos oceánicos (humeros). Problema: altas temperaturas.

o Wächtershauser: la vida comenzó siendo un proceso metabólico: reacción química sobre superficie sólida.

o De Duve: tioésteres darían lugar a moléculas de RNA por reacciones químicas.

o Cairns-Smith: el sustrato sólido serían cristales de arcilla, pero no se ha encontrado arcilla en la evolución.

ORIGEN DE LOS GENES

Procesos:

-Elongación

Consiste en la multiplicación en tándem de secuencias muy cortas de nucleótidos para originar un gen funcional. Ej: colágeno en pollo. Cada exón es una repetición en tándem de 9 pares de nucleótidos. Se han producido muchos cambios en estas secuencias, como sustituciones ocasionales. Ej: Inmunoglobulina de ratón. Los exones que codifican para la región variable poseen 600 nucleótidos de longitud, pero han evolucionado a partir de una secuencia de 48 nucleótidos. Éstos evolucionaron a partir de fragmentos de 14, 21 y 15 nucleótidos, los cuales surgieron de una secuencia única.

-Combinación

Implica asociación de genes ancestrales, que podrían tener distintas funciones y que combinados pueden adquirir una nueva función. En estos casos cada exón codifica un dominio diferente de la proteína. Ej: Hemoglobina, gen de la región constante de la cadena pesada de la Ig ?, gen de la alcohol deshidrogenasa de Drosophila melanogaster.

-Duplicación

Se da a distintos niveles: genes, familias de genes y secuencias repetidas de función desconocida. Tras la duplicación se pueden dar diferentes procesos:

1. Diversificación ? Los genes resultantes de la duplicación evolucionan hacia funciones distintas, generalmente relacionadas. Ej: Hemoglobinas. Existen dos familias ? y ?. Todos los genes de la misma familia tienen una secuencia muy similar. Se sabe que estos genes se han originado a partir de un solo gen ancestral. Otros ejemplos: RNA eucariótico, fosfoglucosa de peces óseos, enzimas digestivas.

2. Intensificación ? Los genes obtenidos por duplicación se mantienen prácticamente idénticos. Son genes que codifican para proteínas con gran demanda. Ej: ARN ribosómico, ARN-t e histonas.

3. Neutralización ? Se produce cuando alguno de los genes pierde su función por una mutación. Son pseudogenes. Ej: en la familia de la Hemoglobina hay distintos pseudogenes, también en la de la actina. Se caracterizan por carecer de los intrones presentes en los genes funcionales.

4. Dispersión ? Consiste en la multiplicación de fragmentos sin función conocida. Podrían ser secuencias espaciadoras o DNA parásito. Ej: secuencias Alu humanas. Existen 300.000 copias en humanos, repartidas por todo el genoma. El fragmento tiene 300 pares de nucleótidos y no se conoce su función. En ratón también existe una secuencia corta repetida 1 millón de veces, pero tampoco se conoce su función.

La mutación es el origen de toda la variabilidad existente. Es importante destacar, que las distintas secuencias evolucionan de forma diferente. Los organismos actuales proceden de otros primitivos, pero se han dado cambios a lo largo de las generaciones. Para que esto sea posible se requiere mutación y selección.

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