Niveles séricos de biomarcadores de fibrosis medidos después del trasplante hepático se asocian a recurrencia grave de la hepatitis C

Niveles séricos de biomarcadores de fibrosis medidos después del trasplante hepático se asocian a recurrencia grave de la hepatitis C

Este artículo fue publicado en: Micheloud D, Salcedo M, Bañares R, Rincon D, Lorente R, Muñoz-Fernández MA, Resino S. Serum levels of fibrosis biomarkers measured early after liver transplantation are associated to severe HCV recurrence. Transpl Infect Dis 2009; 11, 183-188.

Introducción

La infección por el virus de la hepatitis C (VHC) es la principal causa de enfermedad hepática crónica y la indicación más común para trasplante hepático (TH) (1). Sin embargo, la viremia del VHC persiste después del TH y la recurrencia de la hepatitis crónica C se puede demostrar a las 4 semanas después de la TH (2). A pesar de la gravedad de la recurrencia de la hepatitis C, esta es muy variable y la infección persistente con frecuencia se asocia a la fibrosis progresiva (3, 4). Varios marcadores séricos como factores de crecimiento, citoquinas, quimioquinas, moléculas de adhesión, el ácido hialurónico (HA), metaloproteinasas de matriz (MMP) y sus inhibidores (TIMP) se han asociado con la fibrosis en los pacientes infectados por VHC que no han sido sometidos a TH (5).

El objetivo de nuestro estudio fue analizar la relación entre la expresión temprana (3º mes) de un panel de marcadores séricos relacionados con la progresión del daño hepático y la gravedad de la recurrencia del VHC a los 12 meses después del TH.

Pacientes y métodos

Pacientes y diseño

Se realizó un estudio prospectivo en 37 pacientes que recibieron un TH entre febrero de 2002 y diciembre 2005.

a) 19 pacientes recibieron TH debido a la cirrosis por el VHC, todos los cuales estaban infectados por el genotipo 1.

b) 18 pacientes recibieron TH debido a la cirrosis alcohólica, los cuales se utilizaron como grupo control (sin recurrencia del VHC) de los pacientes con VHC.

La recurrencia de la infección por el VHC tras el trasplante fue confirmada por la presencia de ARN del VHC en suero evaluado por PCR. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética Institucional y todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para participar en el estudio.

Inmunosupresión

La terapia inmunosupresora se basó en tacrolimus o ciclosporina asociados a los esteroides, según el protocolo local, con una reducción lenta de los esteroides que fueron suspendidos entre el mes 9º y 12º. El micofenolato mofetil se añadió cuando la toxicidad del inhibidor de la calcineurina se detectó en paciente con insuficiencia renal y neuropatías periféricas (n = 8). La inducción de inmunosupresión por anticuerpos anti-CD25 (basiliximab ®, daclizumab ®) se utilizó sólo en caso de insuficiencia renal antes de trasplante hepático (n = 2). Cuando se sospechó de rechazo agudo, este fue confirmado por biopsia hepática de acuerdo a criterios de Banff y tratados con metilprednisolona.

Variable desenlace

La evaluación de la gravedad de la recurrencia del VHC (variable desenlace) se basó en la biopsia hepática y gradiente de presión venosa hepática mediciones (GPVH) a un año tras el TH. Se consideró recurrencia severa del VHC cuando la biopsia hepática mostró un grado de fibrosis mayor de F1 de la escala METAVIR y/o la presencia de un valor GPVH >6 mmHg.

Marcadores séricos

Se analizaron varias proteínas del suero relacionadas con daño hepático y fibrogénesis en el 3º mes post-TH (variables predictoras). En todos los casos de rechazo, obstrucción biliar y otras complicaciones infecciosas o técnicas o cualquier otra causa de lesión del injerto fueron excluidos para la evaluación de los marcadores biológicos.

Los marcadores analizados fueron el factor de necrosis tumoral (TNF)-a, interferón-inducible proteína 10 (IP-10), proteína quimiotáctica de monocitos-1 (MCP-1), factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), leptina, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), insulina, molécula de adhesión celular vascular-1 soluble (sVCAM-1), molécula de adhesión intercelular soluble-1 (ICAM-1), y MMP-9. Estas moléculas plasmáticas de analizaron por inmunoensayo múltiplex utilizando el analizador Luminex 100 ™ (Luminex Corporation, Austin, TX, EE.UU.) y un kit de Multiplex (LINCOplexTM; Linco Research, St. Charles, MO 63304, EE.UU.).

También se realizaron ensayos de ELISA de acuerdo a las instrucciones del fabricante: la proteína regulada por activación, expresada y secretada por células T normales (RANTES) y la proteína inflamatoria de los macrófagos 1b (MIP-1b) (Bio Source International, Camarillo, CA, EE.UU.), él HA (Echelon Biosciences Inc. Salt Lake City, UT, EE.UU.), inhibidor tisular de metaloproteinasa-1 (TIMP-1) y angiopoyetina 2-(ANG2) (R & D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.). Las concentraciones se analizaron por duplicado.

Análisis estadístico

Con el fin de comparar las diferencias entre grupos de pacientes, la prueba exacta de Fisher se aplicó para las variables categóricas, y Kruskall-Wallis y Mann-Whitney “U” test para las variables cuantitativas. El número de pacientes incluidos en el estudio no permitió el análisis multivariado. Los análisis estadísticos se realizaron con SPSS (versión 12). Todos los valores de p fueron de dos colas. La significación estadística se definió como p <0,05.

Con el fin de analizar la capacidad para predecir la recurrencia severa del VHC en los pacientes, se construyeron curvas ROC (acrónimo de Receiver Operating) para cada parámetro. El análisis de las curvas ROC se realizaron con el software MedCalc (versión 9.4.1.0).

Resultados

Las características demográficas y clínicas de la población de estudio se resumen en la Tabla 1. De los 19 pacientes con hepatitis C, 7 no tuvieron recurrencia grave del VHC (VHC-NSR) y 12 tuvieron recurrencia severa del VHC (VHC-SR). Los grupos fueron similares respecto a variables demográficas (edad, sexo), la gravedad de la enfermedad hepática (Child-Pugh y MELD), variables quirúrgicas y anestésicas (transfusión requisitos y el tiempo total de isquemia), el régimen inmunosupresor, el uso de la enzima convertidora de la angiotensina (ACE) y el rechazo del aloinjerto. Tres (27,3%) pacientes fueron tratados con IFN-alfa contra la hepatitis C justo antes del TH y 8 (66,6%) pacientes con recurrencia severa del VHC fueron tratados con IFN-alfa post-TH, después de que la fibrosis severa fue confirmada. Sólo la edad del donante fue significativamente mayor en pacientes con severa recurrencia del VHC (p <0,05) (Tabla 1).

Tabla 1. Características demográficas y clínicas de los pacientes con trasplante hepático de acuerdo a la etiología y la gravedad de la recurrencia del VHC.

Control No-HCV No recurrencia severa del VHC Recurrencia severa del VHC
Número de pacientes 18 7 12
Edad del receptor (años) 49 (37-65) 46 (35-65) 43 (39-58)
Edad del donante (años) 48.5 (18-81) 60 (26-84) 56 (24-84)
Sexo (femenino) 15 (83.3) 6 (85.7) 8 (66.6)
MELD 15.9 (6.4-40.1) 17.5 (6.4-26.1) 15 (5-19)
Child score
A 2 (11.8%) 1 (14.2%) 0
B 9 (52.9%) 2 (28.4%) 6 (50%)
C 6 (35.3%) 6 (85.7%) 4 (33.3%)
Carcinoma hepatocelular 3 (16.7 %) 1 (14 %) 2 (16.7%)
Necesidades de transfusión
Concentrado de hematíes (unidades) 5 (0-12) 3.2 (0-10) 4 (0-13)
Crioprecipitados 3 (0-21) 3.5 (0-24) 3.5 (0-22)
Unidad de plaquetas 3 (0-10) 4.5(0-15) 4 (0-12)
Tratamiento con IFN-alfa
Pre-TH 1(14.2%) 2(16.6%)
Post-TH 0 8(66.6%)
Inmuno-supresión
Corticosteroides 17 (94.4%) 7(100%) 11(91.6%)
Tacrolimus 13 (72.2%) 5(71.4%) 9(75%)
Ciclosporine 4 (22.2%) 2(28.4%) 3(25%)
Micophenolate 3 (16.6%) 5(71.4%) 0
Basiliximab 1 (5.5%) 1(14.2%) 0
ECA Inhibidor 2 (11.1%) 2(28.4%) 3(25%)
Rechazo del aloinjerto 7 (38.9%) 4(57.1%) 7(58.3%)
Tiempo total de isquemia (horas) 5,30 (1,1) 5,38 (0,5) 5,06 (1)

Los valores se expresan como media (DE) o mediana (mín-máx) y numero absoluto (porcentaje). ECA: enzima convertidora de angiotensina. Los valores de “p” fueron no significativa para todas las comparaciones

* Un paciente de cada grupo fue tratado de acuerdo con un régimen inmunosupresor libre de esteroides.

A un año post-TH, F >1 y / o GPVH > 6 no se encontró en ninguno de los pacientes no-VHC. Las características histológicas y hemodinámicas de los pacientes con recidiva del VHC se muestran en la Tabla 2. En el grupo de VHC-SR, 4 pacientes fueron F2 con un GPVH de 16 mmHg (min.: 10, máx:. 17), 8 pacientes fueron F3 con un GPVH de 13 mmHg (min.: 9, max: 20). El grupo de VHC-NSR tuvieron una GPVH de 3,5 mmHg (min.: 2; máximo: 5.).

Tabla 2. Características histológicas y hemodinámicas de los pacientes con VHC.

Numero de pacientes Severidad de la recurrencia Grado de necroinflamación Estadio de fibrosis GPVH (mmHg)
# 1 No-severa No inflamación No fibrosis 2
# 2 No-severa No inflamación No fibrosis 5
#3 No-severa Inflamación portal leve No fibrosis 3
#4 No-severa Inflamación portal leve No fibrosis 3.5
#5 No-severa Inflamación portal leve No fibrosis 4
#6 No-severa Inflamación portal leve No fibrosis 3
#7 No-severa Inflamación portal leve No fibrosis 4
#8 Severa Inflamación portal leve Fibrosis avanzada ND
#9 Severa Inflamación portal severa Fibrosis avanzada 16
#10 Severa Inflamación portal moderada Fibrosis avanzada 9
#11 Severa Inflamación portal severa Fibrosis avanzada 12
#12 Severa Inflamación portal moderada Fibrosis significativa 17
#13 Severa Inflamación portal moderada Fibrosis avanzada 10
#14 Severa Inflamación portal moderada Fibrosis avanzada 19
#15 Severa Inflamación portal leve Fibrosis avanzada 13
#16 Severa Inflamación portal leve Fibrosis significativa 13
#17 Severa Inflamación portal leve Fibrosis significativa ND
# 18 Severa Inflamación portal severa Fibrosis avanzada 20
#19 Severa Inflamación portal leve Fibrosis significativa 10

La Figura 1 muestra el “heat map” con un gran número de marcadores séricos de fibrosis a los 3 meses post-TH según etiología y el estadio de fibrosis después de 12 meses post-TH.

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Además, también hubo diferencias significativas entre los tres grupos en cuanto a los marcadores biológicos relacionados con varios aspectos de la fibrogénesis, incluyendo la quimiotaxis (IP-10 y MCP-1), la angiogénesis (VEGF y ANG2), la activación endotelial (sVCAM-1) y la síntesis de matriz extracelular (HA) (Tabla 3). Hemos encontrado que los pacientes VHC-SR tuvieron valores más altos de MCP-1, sVCAM-1 que-VHC NSR (P <0,05).

Table 3. Marcadores bioquímicos y biológicos de la fibrosis de acuerdo a la etiología y la gravedad de la recurrencia del VHC.

Control HCV-NSR HCV-SR (a) p (b) p (c) p
AST (UI/L) 19 (9.2) 53 (34) 46.5 (91.2) 0.014 0.004 0.833
ALT (UI/L) 24.5 (15) 56 (33) 56.5 (54.2) 0.007 0.010 0.933
GGT (UI/L) 69 (136.7) 106 (278) 232 (470) 0.263 0.022 0.447
IP-10 (pg/mL) 180.5 (250.9) 348.4 (336.7) 820.2 (2850.2) 0.046 0.001 0.091
MCP-1 (pg/mL) 305.4 (387.9) 172.3 (92.9) 534.4 (433.7) 0.025 0.611 0.043
VEGF (pg/mL) 279.1 (387.5) 43.3 (240.5) 73.35 (151.9) 0.006 0.016 0.735
Angiopoietina-2 (pg/mL) 4737.5 (3589.1) 4596.8 (4450) 8462.5 (5393.7) 0.793 0.022 0.063
sVCAM-1 (ng/mL) 1359.1 (1365.5) 1266.7 (1223.5) 2446.7 (1047.9) 0.672 0.006 0.005
Ácido hialuronico (pg/mL) 326.4 (237.6) 434.6 (405.7) 623.9 (275.9) 0.364 0.001 0.035
TIMP-1 (ng/mL) 302.3 (209.7) 325.1 (129.4) 410.8 (356.1) 0.856 0.079 0.152

Los valores se expresan como mediana (rango intercuartílico).
(a): valor de p para la comparación entre el grupo control y grupo VHC-NSR.
(b): valor de p para la comparación entre el grupo control y grupo VHC-SR.
(c): valor p para la comparación entre el grupo VHC-NSR y grupo VHC-SR.

A fin de evaluar la capacidad predictiva de los marcadores de fibrosis en el diagnóstico de recurrencia severa del VHC, se realizó un análisis de la curva ROC para los diferentes parámetros evaluados en los pacientes con VHC (Figura 2). De acuerdo con este análisis, IP-10 (AUC: 0,74; IC95%: 0,49-0,91, p = 0,043), MCP-1 (AUC: 0,79; IC95%: 0,54-0,94, p = 0,007), sVCAM-1 (AUC : 0,89; IC95%: 0,67-0,98, p = 0,005), y HA (AUC: 0,80; IC95%: 0,55-0,94, p = 0,035) mostraron una capacidad de predicción relevante.

Figura 2. Área bajo la curva ROC de los marcadores de fibrosis para el diagnóstico de recurrencia severa del VHC.

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Discusión

Los resultados de nuestro estudio confirman que una proporción significativa de pacientes con recurrencia del VHC desarrolló daño hepático significativo tras el trasplante. De hecho, ningún paciente sin infección por el VHC desarrolló fibrosis en un año después del TH, mientras que más del 60% de los pacientes VHC+ tenían fibrosis significativa o hipertensión portal, al mismo tiempo. Es importante destacar que cuando se compararon los pacientes con y sin infección por el VHC, se encontraron diferencias significativas en el perfil de varios marcadores relacionados con los mecanismos biológicos asociados con el desarrollo y la progresión de la fibrosis. Además, estos marcadores biológicos fueron capaces de diferenciarse, en fase inicial, a los pacientes que van a desarrollar recidiva severa. También es importante destacar que el patrón bioquímico a los tres meses post-TH fue similares entre los grupos VHC-NSR y VHC-SR, así como el régimen inmunosupresor, características de los receptores, el tiempo de isquemia total, el uso de inhibidores de la ECA, la infección por CMV y episodios de rechazo. Solo la edad del donante fue mayro en el grupo VHC-SR, pudiendo influir en la evolución del TH (6).

Los patrones de expresión de quimioquinas en el aloinjertos hepáticos durante la reinfección por el VHC sugieren que el reclutamiento y posicionamiento de los linfocitos está mediada por quimiocinas específicas (7). Curiosamente, hemos podido observar un aumento gradual en los niveles séricos de IP-10, incrementando estos niveles desde los valores mas bajaos del grupo no-VHC, aumentando en el grupo VHC-NSR, y alcanzando los niveles más altos en los pacientes con VHC-SR. Las proteínas del VHC, solas o por el efecto sinérgico de citocinas, son capaces de estimular la expresión génica de IP-10, la cual correlaciona con las concentraciones séricas de IP-10 (8). Por otra parte, la mayoría de la infiltración de células T en el hígado de los pacientes VHC+ expresan CXCR3 (IP-10 receptor específico) (9), jugando un papel en la patogénesis del VHC mediante la contratación en el parénquima hepático de los linfocitos Th1 efectores, lo que podría contribuir a la respuesta inmune del huésped contra el virus, así como a la progresión de la fibrosis hepática. Por otra parte, nuestros resultados sugieren que la secreción de MCP-1 (quimioquina inflamatoria secretada en el tejido hepático después de la lesión) está asociada con la hepatitis crónica C grave. Estos resultados complementan las observaciones anteriormente publicadas sobre la regulación positiva de quimiocinas en los hígados infectados por el VHC (7). Sin embargo, en este estudio hemos encontrado un patrón similar de CC quimiocinas RANTES y MIP-1b en pacientes no-VHC y VHC. El aumento de sVCAM-1 serico de ha sido descrito previamente en pacientes con enfermedades hepáticas (10), pero la significación clínica es aún controvertida. Nuestros resultados muestran que los niveles más altos se dieron en pacientes con VHC-SR. Este hallazgo podría ser la consecuencia de la activación persistente de las células endoteliales vasculares que son capaces de producir el factor de crecimiento de tejido conectivo, una molécula altamente profibrogénica implicados en la fibrogénesis hepática (7).

Además, se ha demostrado que el VHC es capaz de inducir la expresión de VEGF y ANG2 (11), que están activamente involucrados en la angiogénesis. Por el contrario, no hay información sobre la influencia del VHC en la expresión de VEGF y angiopoyetinas tras el TH. VEGF contribuye a la angiogénesis por la proliferación endotelial y el aumento de la permeabilidad vascular a través de la desorganización de las proteínas de unión endoteliales. Los niveles séricos de VEGF están aumentados en los pacientes con hepatitis aguda, apoynado la afirmación de que el daño hepatocelular agudo conduce a la liberación de VEGF al torrente sanguíneo. Sin embargo, las concentraciones séricas de VEGF están disminuidas en las enfermedades crónicas del hígado, como hepatitis crónica y cirrosis hepática (12). En este estudio, se encontraron diferencias significativas de VEGF en pacientes con y sin hepatitis recurrente por VHC y también en pacientes con recurrencia severa y no severa. Es posible que la secreción de VEGF fuese elevada en los pacientes con VHC, pero la amplia unión a sus receptores específicos pudiera disminuir los niveles séricos de VEGF.

Por último, hemos analizado la posible implicación de los marcadores directos de fibrosis hepática en la predicción temprana de la recidiva grave, los cuales estarían involucrados en el depósito o el retiro de la matriz extracelular (5). Aunque el número de pacientes incluidos en el estudio fue pequeño, parece clara la existencia de un marcado aumento de estos marcadores de fibrosis directos, tales como HA, en los pacientes con VHC y con recidiva grave.

Nuestro estudio tiene varias limitaciones: a) un número pequeño de pacientes que no permite el análisis de subgrupos y análisis multivariado. b) No podemos proporcionar información seriada sobre la histología hepática con la evaluación de la fibrosis, sin embargo este enfoque es extremadamente difícil de realizar en el ámbito clínico.

A pesar de estas limitaciones, nuestros datos preliminares sugieren que los niveles séricos de IP-10, MCP-1, sVCAM-1 y HA evaluados poco después del TH, están asociados la recidiva severa del VHC. La evaluación de estos biomarcadores puede ser útil en la identificación precoz de los pacientes con un mal pronóstico en los que un enfoque terapéutico más agresivo podría ser necesario.

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