Determinación de moléculas solubles mediante ELISA multiplex

1. ELISA MULTIPLEX EN EL ANALIZADOR LUMINEX 100 ™

Se utiliza la »tecnología xMAP®« con el analizador Luminex 200 ™ (Luminex® Corporation, Austin, Texas, Estados Unidos).

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Esta tecnología es multiparamétrica y posibilita el análisis simultáneo de hasta 100 analitos distintos de una misma muestra en un solo pocillo. Ello supone una elevada productividad, reduciendo drásticamente el tiempo requerido, el volumen de muestra necesario y los costes.

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El principio de este análisis es similar a un inmunoensayo tipo sandwich. Los anticuerpos dirigidos contra las citocinas, quimiocinas o factores de crecimiento diana están unidos covalentemente a microesferas teñidas internamente. Las microesferas reaccionan con las biomoléculas diana que estén presentes en la muestra.

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Protocolo:

Los biomarcadores se pueden medir en plasma con kit comercial de ELISA multiplex según las especificaciones del fabricante (Bio-Rad xMAP Assays; Millipore MILLIPLEX MAP assays).

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En general, el protocolo es como sigue:

1) Estándares: se preparan los estándares realizando diluciones seriadas (por ejemplo, 1/4) de un estándar suministrado con el kit resultando 8 estándares que se analizaron por duplicado. Como control negativo se utilizó diluyente del estándar.

2) Muestras: para la preparación de las muestras, se realizan diluciones 1/4.

3) Se procede a humectar la placa con la adición de tampón y eliminación de dicho tampón mediante filtración por vacío. En la placa ya preparada, se adicionan, en primer lugar, las microesferas que llevan incorporado el anticuerpo dirigido frente a las diferentes citocinas, quimiocinas o factores de crecimiento.

4) Se realizan dos lavados de los micropocillos y seguidamente, se añaden los estándares, controles y muestras en el pocillo correspondiente y se incuba la placa a temperatura ambiente en agitación durante 30 minutos.

5) Después de la incubación de las muestras, se realizan 3 lavados y se añade el anticuerpo de detección (marcado con biotina) a cada pocillo y se incuba la placa a temperatura ambiente en agitación durante 30 minutos. Esto resulta en la formación de un sandwich de anticuerpos alrededor de la citocina, quimiocina o factores de crecimiento diana.

6) Tras 3 lavados, se adiciona la solución de estreptavidina-ficoeritrina (SAPE) a cada pocillo y se incuba la placa a temperatura ambiente en agitación durante 10 minutos. El SAPE se une al anticuerpo de detección biotinilado en la superficie de la microesfera. Posteriormente, se realiza una serie de lavados antes de la detección.

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Los datos de la reacción se adquieren usando el sistema Luminex® (Austin, TX, EEUU) que es un instrumento basado en citometría de flujo que permite cuantificar la intensidad de las reacciones bioquímicas que tienen lugar en la superficie de las microesferas. Lleva incorporados dos láseres y un sistema óptico para la detección de dichas reacciones.

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Además, incluye un sistema informático de captura, procesamiento y transformación de la señal fluorescente en señal digital, permitiendo así el análisis de los resultados. Uno de los láseres emite una radiación con una longitud de onda capaz de excitar las moléculas de fluorocromo contenidas en las microesferas. La intensidad de la fluorescencia emitida por éstas permite diferenciar el analito que se mide en cada caso (fluorescencia interna de las microesferas). El otro láser excita las moléculas de ficoeritrina (PE) que se añaden al final del ensayo (fluorescencia en la superficie de las microesferas). El sistema óptico de detección del Luminex® permite revelar la intensidad de la reacción que tiene lugar en la superficie de las microesferas y el software del Luminex® calcula automáticamente la concentración de cada citocina en la muestra problema, empleando una curva estándar derivada de una suspensión de citocinas estándar, de concentración conocida y de la que se hacen diluciones seriadas. La figura muestra la pantalla del programa donde se recogen en una tabla los valores de cada citocina y en los gráficos las regiones en que se distribuyen las microesferas así como la intensidad luminosa que emite la muestra.

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Para una adecuada adquisición de los datos, las microesferas están teñidas con una combinación de dos colorantes fluorescentes en proporciones conocidas de manera que cada microesfera tiene asignado un número (región de la microesfera) del 1 al 100 según el ratio de los dos colorantes fluorescentes. Los valores del último estándar fueron considerados como límites de detección para cada mediador, tal y como recomienda el fabricante. Aquellos valores por debajo del nivel de detección se equipararon al nivel de detección.

Se adquiere un mínimo de 100 eventos (beads) para cada muestra de proteína, obteniéndose valores de intensidad media de fluorescencia. Las concentraciones analíticas de proteína se calculan a partir de una curva estándar utilizando MasterPlex ™ QT Analysis versión 2 (MiraiBio, Inc., Alameda, CA) utilizando una fórmula de regresión con cinco parámetros. El límite inferior y superior de detección de la técnica es variable dependiendo del kit que se esté utilizando.

2. ELISA MULTIPLEX EN EL ANALIZADOR FACSCALIBUR FLOW CYTOMETER ™.

La citometría de flujo es una técnica de análisis que mide las características de dispersión de luz y fluorescencia que poseen células o partículas conforme se las hace pasar a través de un rayo de luz. Para su análisis por citometría de flujo, las células o partículas deben encontrarse individualmente en suspensión en un fluido. Al atravesar el rayo de luz, las partículas interaccionan con este causando dispersión de la luz, basándose en la difracción de la luz en sentido frontal, se puede evaluar el tamaño de las células que pasan y al medir la reflexión de la luz de manera lateral se evalúa la granularidad o complejidad de estas. Las microesferas unidas a anticuerpos monoclonales marcados con fluoróforos diferencian a los antígenos complementarios que se unen a ellas.

En este caso, se utiliza el ELISA multiplex FlowCytomixTM (ComboplexTM Bender MedSystems, Viena, Austria) con un cítómetro de flujo como el FACSCalibur (BD FACSCalibur™, BD Biosciences, California USA) según las especificaciones del fabricante.

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Protocolo: El principio de este análisis es similar a un inmunoensayo tipo sándwich descrito en la sección anterior.

1) Estándares: se preparan los estándares realizando diluciones seriadas (por ejemplo, 1/4) de un estándar suministrado con el kit resultando 7 estándares que se analizaron por duplicado. Como control negativo (blanco) se utilizó diluyente del estándar.

2) Muestras: para la preparación de las muestras se pueden realizar diluciones en función de la molécula a analizar.

3) Se procede a humectar la placa con la adición de tampón y eliminación de dicho tampón mediante filtración por vacío. En la placa ya preparada, se adiciona, en primer lugar, la mezcla de microesferas que llevaban incorporado el anticuerpo dirigido frente a las diferentes citocinas, quimiocinas o factores de crecimiento y en segundo lugar, el anticuerpo de detección (marcado con biotina).

4) Se añadie posteriormente los estándares, controles y muestras en el pocillo correspondiente y se incuba la placa a temperatura ambiente en agitación durante 2 horas.

5) Después de la incubación de las muestras, se realizaran 3 lavados a cada pocillo y se adiciona la solución de estreptavidina-ficoeritrina (SAPE) a cada pocillo y se incuba la placa a temperatura ambiente en agitación durante 1 hora. El SAPE se une al anticuerpo de detección biotinilado en la superficie de la microesfera. Por último, se realizan una serie de lavados antes de la detección.

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Las microesferas se diferencian por sus tamaños e intensidad de fluorescencia captada por citometría de flujo. En el ensayo FlowCytomixse utilizan dos microesferas de distintos tamaños (4 micras y 5 micras). Cada uno de los dos tamaños de las poblaciones de microesfera consiste en que se diferencian por las diversas intensidades de un colorante fluorescente. El medio de contraste puede ser excitado con un Argón, He-Ne, o incluso láser UV, y emite en el extremo rojo (690 nm) que se detecte en el canal FL-3/FL-4. La combinación de las dos bolas de diferentes tamaños y diferentes intensidades de flourescencia hace posible distinguir hasta 20 juegos de microesferas fluorescentes diferentes. La Estreptavidina-PE, que se une al conjugado de biotina, emite a 578 nm y se detecta en el canal FL-2 y permite la cuantificación del analito.

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Los valores del último estándar son considerados como límites de detección para cada mediador, tal y como recomienda el fabricante. Aquellos valores por debajo del nivel de detección se equiparan al nivel de detección.

Se obtienen un mínimo de 300 eventos (beads) para cada muestra, obteniéndose valores de intensidad media de fluorescencia. Las concentraciones de proteína analito se calculan automáticamente sobre la base de datos de la curva estándar utilizando FlowCytomix Pro 2.3 Software ™ (Bender MedSystem, Viena, Austria).

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