Epidemiología genética en pacientes coinfectados por VIH/hepatitis C

El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y el virus de la hepatitis C (VHC) comparten vías de transmisión y en consecuencia las coinfecciones son relativamente frecuentes, muy especialmente en pacientes que sufren adicción a drogas por vía parenteral (ADVP). En España se calcula que la prevalencia sérica de VHC en pacientes con VIH es de 61-65% (1). Por otro lado, la introducción del tratamiento antirretroviral de gran actividad (TARGA) ha convertido a la infección por VIH en una infección crónica (2), siendo la enfermedad hepática por el VHC la que ocupa actualmente uno de los primeros lugares entre las causas de morbilidad y mortalidad en los pacientes infectados por VIH (3). La historia natural de la infección por el VHC está acelerada en pacientes VIH (progresiva insuficiencia hepática, hipertensión portal, cirrosis y carcinoma) (4, 5), existiendo mayor riesgo de desarrollo de cirrosis histológica y descompensación de la hepatopatía en pacientes coinfectados por VIH/VHC en comparación con pacientes monoinfectados por VHC (4, 6). Actualmente el tratamiento recomendado frente al VHC en todos los pacientes coinfectados por el VIH es interferón (IFN) pegilado (pegIFN-alfa) y ribavirina (RBV) (7, 8), con una respuesta viral sostenida (RVS) del 50%-60% para el genotipo 1 y del 80%-90% para los genotipos 2 o 3 (9, 10).

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La fibrosis hepática se considera el factor más determinante en la severidad de la infección por VHC y el factor más importante para iniciar la terapia antiviral frente al VHC (11). Durante la hepatitis aguda, el hígado tiene una gran capacidad de regeneración gracias a la cual se reestablece la arquitectura hepática normal en poco tiempo. Durante este proceso reparativo existe una reacción inflamatoria junto a un depósito de matriz extracelular (MEC) constituido por colágeno no fibrilar (12). Sin embargo, si tras la cronificación de la infección se mantiene la necrosis hepática, el proceso reparativo se perpetúa y pierde eficacia con el tiempo, aumentando considerablemente la producción de MEC (12, 13). La fibrosis es la resultante neta de ambos procesos (destrucción/reparación) (14) en el que intervienen una serie de proteínas como las metaloproteinasas de la matriz extracelular (MMP) que degradan la MEC, e inhibidores tisulares de las metaloproteinasas (TIMP) que bloquean a las MMP y previenen su acción fibrolítica. Este equilibrio entre estos dos tipos de proteínas varía según el estadio de la lesión hepática (13, 15). En todo este proceso, las células estrelladas hepáticas (HSC de “hepatic stellate cells”) sufren una transformación fenotípica o “activación celular” caracterizada por la adquisición de funciones típicas de los miofibroblastos, como la contractilidad celular y la secreción de citocinas proinflamatorias y de matriz extracelular (16). Las sustancias que regulan la transformación fenotípica y la proliferación de las HSC derivan en su mayoría de los hepatocitos dañados, de las células de Kupffer activadas y del propio infiltrado inflamatorio. El factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento transformador tipo beta (TGF-beta) y una serie de sustancias vasoactivas (trombina, angiotensina II y endotelina-1) contribuyen a la acumulación de HSC activadas y ejercen, por consiguiente, una acción profibrogénica en las hepatopatías crónicas (12, 17). Por el contrario, diversas citocinas como el IFN-gamma y el factor de crecimiento hepatocitario (HGF) son potentes inhibidores de la activación de las HSC (12, 17).

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La replicación viral a nivel hepático va a provocar una respuesta inmunológica generalizada que se caracteriza por la acumulación de leucocitos en el hígado y formación de folículos linfáticos (18). Todas estas células linfoides son grandes productoras de citocinas tanto Th1 como Th2 que van a poder dirigir la eliminación del VHC como la fibrosis hepática (19, 20). Estas citocinas pueden jugar un papel tanto potenciando como inhibiendo la replicación del VIH y VHC y pueden estar afectadas por la replicación viral (21, 22). El cambio de un patrón de producción de citocinas TH1 a TH2 ha sido propuesto como un elemento crítico en la progresión de la enfermedad por VIH y VHC (21, 22), y este patrón puede revertir durante el tratamiento antiviral (23, 24). Estas células Th1 sintetizan IL-2 e IFN-g, que tienen actividad antiviral y son esenciales para las respuestas de los CTLs efectores virus-específicos (25). Por el contrario, respuestas Th2 antiproliferativas (IL-4, IL-5) características de la supresión inmune se han asociado con progresión de la enfermedad durante la infección viral (21). Por otro lado, la citocinas proinflamatorias como TNF-alfa, IL-1, IL-6, IL-13 y las antiinflamatorias como IL-10 e IL-11 pueden estar en un equilibrio dinámico y con el tratamiento antiviral este equilibrio desplazarse hacia las citocinas antiinflamatorias tal como sucede en otros cuadros donde existe un fenómeno inflamatorio crónico como en la la fibrosis del asma severo (26).

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En relación a los factores dependientes del huésped, se sabe de la influencia del síndrome metabólico (resistencia a la insulina, obesidad) o la Diabetes Mellitus (27). En diversos estudios se ha encontrado una mayor prevalencia de diabetes en pacientes infectados con VHC (28) y en pacientes coinfectados por VIH y VHC (29). Por otro lado, los pacientes con síndrome metabólico evolucionan más desfavorablemente (30) y tienen una peor respuesta al tratamiento con IFN-alfa y Ribavirina (31, 32). También se ha encontrado que la pérdida de peso en pacientes con Hepatitis C puede asociarse a una reducción en la esteatosis hepática junto con una mejoría de la fibrosis a pesar de la persistencia del virus (33), proceso que se ha asociado con una desactivación de las HSC (34). La resistencia a la insulina induce resistencia al interferón al interferir en sus rutas de activación en las que intervienen Janus kinasas (Jak1) y tirisin kinasas (Tyr2) (35). Esta hiperinsulinemia puede bloquear la acción del interferón de forma que ante altas concentraciones de insulina, la replicación del virus C no es inhibida por interferón debido a una incapacidad para promover la síntesis de proteínas antivirales (36). En resumen, el VHC induce resistencia a la insulina que desemboca en una resistencia al interferon. Por otro lado, en los últimos años se ha encontrado que las adipokinas tienen un papel fundamental en este proceso, relacionando la resistencia a la insulina con la EHNA (37). El adipocito es capaz de secretar un conjunto de sustancias potencialmente tóxicas tales como el factor de necrosis tumoral (TNF), leptina, resistina y ácidos grasos cuya concentración se correlaciona con la resistencia a la insulina, lo que debe ser relevante en el desarrollo de la diabetes tipo 2 y en la progresión de la fibrosis hepática. Además se ha observado que la leptina también es un regulador de la secreción de citocinas proinflamatorias como IL-10 y TGF-beta, y podrían actuar directamente sobre las células estrelladas favoreciendo el aumento de la fibrosis (37).

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Se han publicado muy pocos estudios con SNPs en pacientes coinfectados por el VIH y VHC, encontrando diferencias con los pacientes monoinfectados por el VHC (38, 39). En este sentido, nosotros creemos que la infección por el VIH en los pacientes con infección crónica por el VHC es un factor “ambiental” de especial importancia. Determinados SNPs pueden tener una penetrancia (proporción de individuos que presentan un genotipo causante de enfermedad y que expresan el fenotipo patológico) significativa ó no-significativa en pacientes monoinfectados por VHC como ya se ha publicado en estudios previos, pero que se manifiesten con una penetrancia distinta (posiblemente mayor) en los pacientes coinfectados por el VIH/VHC.

Durante estos últimos años se ha ampliado el conocimiento del genoma humano, ayudando a la tarea de definir la fisiopatología y dar un nuevo enfoque terapéutico al poder permitir una selección individualizada del mejor régimen terapéutico disponible para cada paciente (40). Sin embargo, el enorme número de genes y polimorfismos genéticos dificulta su estudio (41, 42). Además, la mayoría de las enfermedades más comunes y las respuestas variables a fármacos tienen un origen complejo en el cual intervienen factores genéticos y ambientales tal como sucede en la hepatitis C (43). Se calcula que hay más de 10 millones de variaciones en el genoma y la forma más frecuente de variación con los polimorfismos genéticos de un solo nucleótido (SNPs) que consisten en una sustitución de una base por otra, presentándose con una frecuencia superior al 1% en la población (44). Solo el 20% de los SNPs totales están relacionados con variaciones genéticas de algún gen de interés, representando miles de variaciones genéticas que contribuyen directamente a la diversidad estructural genética humana (44). Cada una de las formas de un gen o marcador como un SNP se denomina alelo y estos diferentes alelos producen variaciones en las características hereditarias. En principio, los SNPs no alteran el fenotipo de un individuo pero en determinadas condiciones ambientales pueden afectar a la función génica determinando la susceptibilidad de padecer una enfermedad o la respuesta a un tratamiento farmacológico (40). Así, sería posible determinar qué SNPs se asocian a la progresión de la fibrogénesis y cirrosis, así como la respuesta al tratamiento antiviral para pronosticar la evolución de la enfermedad hepática (45). De hecho, ya se han publicado varios estudios en los que se ha investigado la relación de los polimorfismos genéticos con la fibrogénesis y cirrosis; siendo la mayoría de ellos, genes relacionados con el sistema inmune y factores de crecimiento (41, 42, 45). Por ejemplo, ha sido demostrada la asociación entre distintos SNPs correspondientes a TNF-alfa , HLA-I y –II, IL-10, MxA, etc. (45, 46) con progresión de la enfermedad y respuesta al tratamiento antiviral. Además, aun esta pendiente un análisis exhaustivo de las señales reguladores “downstream” para distintas rutas relacionadas con citocinas, apoptosis y factores de crecimiento. Ej: El IFN a/b es la primera línea de defensa en el control de las infecciones virales. Esto es alcanzado cuando el IFN se une a su receptor en la superficie celular, pasando la señal al núcleo a través de la activación de Janus kinasas (JAK-STAT) (47). Esto desencadena la activación de un gran numero de genes (aprox. 700) que intervienen en un gran numero de procesos fisiológicos (46). Sin embargo, la combinación de estas moléculas en cada persona determinará distinto grado de respuesta al IFN que varía según el polimorfismo de cada gen, especialmente los SNPs que afectan a la cantidad y funcionalidad de la proteína producto. El conocimiento de la importancia de los SNPs en la hepatitis C tienen dos aplicaciones importantes: a) el diagnostico predictivo que es decisivo para realizar un diagnóstico temprano de evolución de la enfermedad (progresor/no-progresor) que permitiría anticiparse con medidas terapéuticas efectivas; y b) la posibilidad de predecir la respuesta de un paciente a un fármaco determinado aumentando la eficacia y disminuyendo los efectos secundarios del tratamiento.

Después de encontrar asociaciones entre SNPs con el evento clínico, es necesaria la construcción y validación de un modelo matemático capaz de predecir el fenotipo clínico. Estos modelos normalmente incluyen a más de un SNPs porque un solo SNPs no contiene la información suficiente para clasificar a los pacientes correctamente (48). Así, la predicción de enfermedades complejas es mejorada considerando múltiples alelos a la vez. Las técnicas estadísticas y bioinformáticas desarrolladas actualmente para la clasificación correcta de las pacientes han evolucionado extraordinariamente en los últimos años. La regresión logística es el método clásico para la combinación lineal de varios genotipos y su interacción (49). Sin embargo estos métodos requieren la enumeración de varios términos de interacción que dificultan su interpretación y aplicación. Cuando el número de SNPs seleccionados es elevado, la alternativa es un modelo computacional más complejo que soporta mayor número de interacciones, como sucede en los algoritmos que utilizan técnicas de algoritmos genéticos y algebra de Boole (GABA), la técnica de factores de la reducción de la dimensionalidad (MDR), o el análisis por redes neuronales (48).

Nosotros pretendemos determinar un número elevado de SNPs (384 SNPs/paciente) en un número elevado de muestras biológicas. Para la selección de los SNPs a determinar y el análisis genético de los datos utilizaremos distintos recursos bioinformáticos. La Bioinformática se ocupa de investigar y desarrollar modelos, métodos y herramientas útiles para el manejo de la enorme cantidad de información disponible en biomedicina, que incluye datos sobre genes, estructuras moleculares, función bioquímica, conducta biológica y su influencia en las enfermedades y en la salud (50). Este enfoque integrador de la información procedente de diversas fuentes se orienta al estudio de las bases genéticas que intervienen en la variación fenotípica humana para así poder determinar la susceptibilidad individual a enfermedades y guiar a una selección eficiente de marcadores para diagnóstico y tratamiento. Mediante el uso y desarrollo de programas y herramientas bioinformáticas se puede analizar información procedente de diferentes bases de datos de secuencias de nucleótidos, proteínas, mutaciones y desordenes genéticos (51) que necesita la investigación biomédica. En los últimos tiempos se están produciendo grandes avances en el desarrollo de herramientas para la identificación de genes y para el almacenamiento, anotación y comparación de secuencias, en lo que se denomina biología in silico (52); participando de una forma decisiva en los grandes proyectos de identificación de SNPs y haplotipos en tareas relacionadas estudios de asociación genética (53). Actualmente se encuentran disponibles diversas bases de datos de SNPs y haplotipos tanto públicas como privadas entre las que destacan por su importancia la base de datos generada por el Proyecto HapMap (http://snp.cshl.org/cgi-perl/gbrowse/hapmap_B35/) (53) y las generadas por el NCBI (dbSNP) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/) y el Sanger Centre (Copy number variation project) (http://www.sanger.ac.uk/humgen/cnv/help/). La bioinformática, además, puede facilitar la obtención de conocimiento empleando la información almacenada en diversas bases de datos relacionadas (Biología de Sistemas), como: rutas metabólicas, rutas de señalización y redes genéticas e interacciones (54). El proceso integrado de esta información puede ayudar a realizar estudios asociativos en los que se empleen los SNPs como marcadores para diagnóstico y tratamiento de enfermedades complejas (55).

En resumen, las distintas técnicas bioinformáticas nos van a permitir conseguir tres objetivos fundamentales: a) desarrollar un modelo para selección “in silico” de SNPs relevantes en el estudio, mediante la recuperación de información de bases de datos de referencia y filtrado siguiendo sistemas de decisión multicriterio, b) estructurar la información clínica y la procedente de las técnicas experimentales, generar algoritmos de agrupación ó clasificación aplicados a los datos de los pacientes, útiles para realizar el análisis predictivo; c) intentar encontrar justificación biológica para la relevancia de los SNPs encontrados, al estudiar las interacciones biológicas, redes metabólicas, redes transcripcionales, o redes de regulación implicadas.

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