Generación de la diversidad: Inmunoglobulinas

6.1. ANTICUERPOS

6.1.1. VARIABILIDAD DE LAS INMUNOGLOBULINAS.

6.1.2. PROCESO DE REORDENAMIENTO GÉNICO.

6.1.2.1. RECOMBINACIÓN DE LAS CADENAS PESADAS.

6.1.2.2. RECOMBINACIÓN DE GENES DE CADENAS LIGERAS.

6.1.2.3. REGIONES DETERMINANTES DE LA COMPLEMENTARIDAD

6.1.2.4. SECUENCIAS SEÑALIZADORAS DE RECOMBINACIÓN (RSS).

6.1.2.5. FLEXIBILIDAD DE UNIÓN: REORDENACIONES PRODUCTIVAS Y NO PRODUCTIVAS.

6.1.3. GENERACIÓN DEL REPERTORIO DE ANTICUERPOS.

6.1.3.1. MÚLTIPLES GENES de la línea germinal.

6.1.3.2. DIVERSIDAD COMBINATORIA.

6.1.3.3. DIVERSIFICACIÓN DE LA REGIÓN AMINOTERMINAL (RECOMBINACIÓN VARIABLE).

6.1.3.4. COMBINACIÓN DE CADENAS PROTEICAS H y L.

6.1.3.5. HIPERMUTACIÓN SOMÁTICA.

6.1. ANTICUERPOS

6.1.1. VARIABILIDAD DE LAS INMUNOGLOBULINAS.

La principal características de los genes de las Ig, es el hecho de la diversidad de proteínas que codifican. Esta diversidad es mas llamativa en los lugares de reacción con el Ag (extremo N terminal de las VC y VL). El repertorio primario de anticuerpos consiste en el total de Ac que un individuo puede producir en una respuesta a una primera inmunización con diferentes antígenos. Viene determinado en cada individuo por el número de clones de LB existentes previos a la inmunización (109 o más).

Existen mecanismos de diversificación separados para cada una de las cadenas, ya que están codificadas en distintos cromosomas. El análisis del genoma humano mostró que segmentos separados de DNA (cromosomas 2 y 22) codifican para las regiones C y V de las cadenas ligeras, en las células productoras de Ac. En los LB diferenciados, las regiones V y C están cerca y unidos por un segmento J (ya se ha producido la recombinación y el DNA está reordenado).

Peptido Cromosoma
IgH 14
Lambda 22
Kappa 2
TcR-alfa 14
TcR-beta 7
TcR-delta 14
TcR-gamma 7

Cada uno de estos complejos está formado por tres o cuatro regiones V (variable), D (diversidad), J (unión) y C (constante). La región V,J, y D están formadas por familias de genes, y cada uno de los genes V y C por exones e intrones. En este contexto, gen significa una secuencia de DNA que codifica para una parte discreta de la Ig final. Para construir una unidad que pueda ser expresada, un gen V debe unirse físicamente a uno C y después codificar un polipéptido.

– Los loci de las cadenas C y L están constituidos por múltiples genes separados por fragmentos no codificables.

– En el extremo 5′ de cada locus están los exones de la región V, precedido por un exon para el peptido señal. El número de genes V (kappa y lambda) varía según la especie.

– En el extremo 3′ se encuentran los genes C. Los genes de las cadenas pesadas (CH) se encuentran dispuestos de una forma secuencial. Cada región C esta compuesta por tres o cuatro exones (región C) y peptidos más pequeños que codifican para el extremo C-terminal.

– Entre los genes C y V se encuentran, y separados por intrones, secuencias codificantes adicionales J y D que van a codificar el extremo C-terminal de la región V y las CDR.

Por tanto:

En una cadena ligera, la región variable está codificada por V, J y la región constante por un exon C.

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En la cadena pesada, la región variable esta codificada por V, D y J; y la región constante por múltiples exones C.

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6.1.2. PROCESO DE REORDENAMIENTO GÉNICO.

Las inmunoglobulinas funcionales se producen durante la maduración de los linfocitos B en un proceso en el que los segmentos se reordenan, de modo que se colocan adyacentes un segmento de cada tipo de los que intervienen en la codificación de cada tipo de cadena:

– V+J de cadenas L (lambda o kappa) determinan la región VL de la cadena ligera.

– V+D+J de cadenas H determinan la región VH de la cadena pesada.

– En cada caso, el segmento C, se coloca cercano al conjunto ya reordenado de V+J o V+D+J para determinar la correspondiente región constante.

– El pequeño segmento L acompaña en 5’ a cada segmento V. Determina un péptido líder corto que sirve para guiar a la cadena polipeptídica en formación hacia el retículo endoplásmico rugoso. Durante el proceso de secreción este péptido se elimina, por lo que no participa de la Ig madura.

La recombinación la lleva a cabo el complejo recombinasa VDJ, que es común para el reordenamiento de los genes del TcR. En la mayoría de los linfocitos B en desarrollo, la recombinación se inicia en la cadena pesada de las Ig.

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6.1.2.1. RECOMBINACIÓN DE LAS CADENAS PESADAS.

El reordenamiento tiene lugar con un orden preciso. El primer reordenamiento une un segmento génico D con un J, posteriormente se une a uno de los genes V formando un complejo VDJ. Los genes de la región C están separados por un intrón de VDJ, y los RNAhn tienen la misma organización. El procesamiento posterior del RNAhn une VDJ con los genes C para formar el RNAm funcional de la cadena pesada mu. Los genes VDJ corresponden con la región VH y los genes C con CH.

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El RNA primario será procesado por medio de una poliadenilación y corte-empalme diferenciales, que producen dos tipos de ARN mensajeros:

– ARNm para cadenas mu: incluye los segmentos L-V-D-J-Cm -poliA

– ARNm para cadenas delta: incluye los segmentos L-V-D-J-Cd -poliA.

Obsérvese que ambos tipos de ARNm son iguales en lo que respecta a L-V-D-J (la porción que al ser traducida creará la parte de unión al Ag), pero que van a determinar dos isotipos diferentes de anticuerpos.

Cada ARNm es traducido y procesado (eliminación del péptido líder), generándose, respectivamente, cadenas pesadas de tipo mu y delta, pero con la misma especificidad. Cuando dichas cadenas se combinen independientemente con cadenas ligeras, se obtendrán IgM e IgD de la membrana del linfocito B maduro.

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La cadena mu o delta sintetizada en un LB en desarrollo regula la recombinación somática de dos formas:

a) La proteína mu generada inhibe irreversiblemente el reordenamiento en el otro cromosoma, explicando así la exclusión alélica. Los genes de las cadenas pesadas del cromosoma alélico sufrirán reordenamiento sólo si el primer reordenamiento ha sido improductivo.

b) La producción de una proteína mu en un linfocito pre-B y expresión en membrana, estimula el reordenamiento de las cadenas ligeras.

6.1.2.2. RECOMBINACIÓN DE GENES DE CADENAS LIGERAS.

La siguiente recombinación somática del DNA afecta a los loci de las cadenas ligeras (kappa primero y luego lambda). La expresión completa de Ig conduce a la generación de LB en los que cesa la recombinación VDJ y las células migran hacia la periferia.

El mecanismo seguido es similar al de las cadenas pesadas: un segmento V se une a otro J, formando un complejo VJ que está separado por un intrón de la región C. El RNAhn mantiene el mismo orden y la eliminación posterior del intrón acerca VJ a C en el RNAm. La cadena ligera formada se une a la cadena mu existente para formar IgM de membrana (LB inmaduro).

El ARNm se une a ribosomas en la superficie del retículo endoplásmico rugoso, con lo que comienza su traducción. Lo primero que surge es la parte correspondiente al péptido líder, que empuja a la cadena polipeptídica en crecimiento al lumen (interior) del RER; finalmente, la cadena proteica se escinde a nivel del péptido líder, quedando la cadena ligera en el interior del RER.

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6.1.2.3. REGIONES DETERMINANTES DE LA COMPLEMENTARIDAD

La comparación de secuencias mostró que en la región variable existían posiciones que variaban con una frecuencia mucho mayor. Estas posiciones se acumulaban en tres regiones de la cadena pesada y tres de la liviana. Dichas regiones se denominaron regiones determinantes de la complementaridad (CDR). El conocimiento de estructura de Ig obtenido a través de cristalografía de rayos X mostró que los 6 CDR se agrupan en una misma región del espacio formando el paratope.

Los CDR3 de cada cadena ocupan la porción central del paratope y tiene un papel fundamental en la interacción con el antígeno. Los CDR3, son los más diversos dentro de las inmunoglobulinas.

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6.1.2.4. SECUENCIAS SEÑALIZADORAS DE RECOMBINACIÓN (RSS).

Existen secuencias en los intrones, próximas a los genes V y J de las cadenas ligeras o en los genes V-D-J de las cadenas pesadas, implicados en la recombinación. En los intrones existen secuencias complementarias (se unen y forman lazos) que actúan de señal para la recombinación (corte y unión). Este patrón de emparejamiento permanece constante en la escala filogenética:

heptámero -espaciador (12-24 pb) – nonámero

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Esto supone que podemos distinguir dos tipos de secuencias RSS:

– RSS de una vuelta (con 12 nucleótidos intercalados entre el heptámero y el nonámero. Obsérvese que se llaman de una vuelta porque doce pares de bases corresponde aproximadamente a la distancia de una vuelta de la hélice del ADN).

– RSS de dos vueltas (con 23 nucleótidos intercalados).

Se disponen de la siguiente manera:

– al lado 3’ de cada segmento V.

– al lado 5’ de cada segmento J.

– a ambos lados de cada segmento D.

Ademas, hay un esquema de disposición característico de RSS de una vuelta y de dos vueltas respecto de los segmentos V, D y J:

– en las cadenas lambda, en el lado 3’ de cada segmento V hay una RSS de dos vueltas, mientras que en el lado 5’ de cada segmento J hay una RSS de una vuelta.

– En las cadenas kappa, en el lado 3’ de cada V hay una RSS de una vuelta, mientras que en el lado 5’ de cada J hay una RSS de dos vueltas.

– En las cadenas pesadas, tanto el lado 3’ de V como el lado 5’ de J posee una RSS de dos vueltas, mientras que ambos lados de cada segmento D poseen RSS de una vuelta.

Esta disposición permite que la reordenación de segmentos sea por emparejamientos entre dos secuencias RSS, de modo que sólo se puede emparejar una RSS de una vuelta con otra RSS de dos vueltas. Esta regla asegura que los segmentos VL sólo se unirán a segmentos JL, y que los segmentos VH, DH y JH se unirán en el orden adecuado, evitándose las uniones “ilegítimas” entre segmentos del mismo tipo.

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La recombinación es llevada a cabo por una recombinasa específica de linfocitos y enzimas generales tales como ligasas y exonucleasas. La recombinasa tiene dos subunidades de unión al DNA:

– Una reconocedora de la señal con espaciador de 12 pb.

– Otra reconocedora de la señal con espaciador de 22-24 pb.

Se han identificado dos genes de activación de recombinación, RAG1 y RAG2 cuyos productos actúan sinérgicamente en la unión de los segmentos V-(D)-J. Inducen roturas de cadena doble en el ADN a nivel del límite entre RSS y secuencias codificadoras, y sólo actúan sobre el ADN de línea germinal de las inmunoglobulinas ó en los genes de las cadenas de TCR. Sólo se expresan en precursores de células B ó T, pero no en linfocitos maduros.

La reordenación de genes de cadenas H parece estar controlada por el ciclo celular ya que los genes RAG actúan en células detenidas en fase G1 del ciclo y la reordenación productiva parece conducir a la inhibición de la actividad RAG-2.

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6.1.2.5. FLEXIBILIDAD DE UNIÓN: REORDENACIONES PRODUCTIVAS Y NO PRODUCTIVAS.

Aunque el mecanismo de recombinación es bastante preciso en el límite entre RSS y secuencias codificadoras, la ulterior unión entre las secuencias codificadoras de dos segmentos génicos presenta una gran flexibilidad (variedad), lo cual contribuye a la hipervariabilidad del sitio de unión del antígeno, afectando a la CDR3. En el empalme no está determinado qué nucleótido del extremo de un segmento se va unir con no importa qué otro nucleótido del otro segmento implicado en la unión.

Por lo tanto, cuando se tenga la fusión entre los dos segmentos, el mensaje fusionado resultante puede estar o no estar en fase adecuada para que la traducción en los ribosomas genere un polipéptido funcional. A las reordenaciones que están en fase (se entiende fase adecuada para su correcta traducción) se las llama reordenaciones productivas, mientras que las que no han resultado en fase, se denominan reordenaciones no productivas. Muchas de estas últimas poseen en sentido 3’ respecto de la zona de fusión, codones sin sentido (de parada de traducción), por lo que generan proteínas truncadas totalmente no funcionales.

Si una célula B en desarrollo reordena uno de los dos alelos de un tipo de cadena de inmunoglobulina, y resulta no productiva, entonces lo intenta con el otro alelo. Si el reordenamiento de los genes kappa es productivo, se inhibe el reordenamiento de los genes lambda. Sólo hay reordenamiento lambda cuando los genes kappa de ambos cromosomas son improductivos. Si tampoco es productivo, la célula entra en apoptosis. En la médula ósea, sólo un 8 % de de las células pre-B llegan a la madurez y logran salir como linfocitos B maduros e inmunocompetentes.

La exclusión alélica es el hecho de que cada célula B exprese sólo uno de los dos alelos de cada tipo de cadena (pesada y ligera) de inmunoglobulina. Ello asegura que cada célula B tenga sólo una determinada especificidad antigénica.

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6.1.3. GENERACIÓN DEL REPERTORIO DE ANTICUERPOS.

Varios mecanismos genéticos contribuyen a la diversidad de Ac secretados y unidos a membrana. Esta diversidad es antígeno independiente y se origina durante la maduración clonal.

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6.1.3.1. MÚLTIPLES GENES de la línea germinal.

Ya hemos hablado de la variedad de segmentos de las familias multigénicas, sobre todo de tipo Vk y VH, pero también de tipo J y D que codifican para las regiones CDR.

6.1.3.2. DIVERSIDAD COMBINATORIA.

La asociación combinatoria de diferentes segmentos génicos V, D y J permite una amplia generación de diferentes especificidades de Ac. Cada clon de LB y su progenie expresa sólo una de estas combinaciones VDJ (Recombinación somática).

– 300 tipos de VH x 13 tipos de DH x 4 tipos de JH = 1.6·104 tipos de cadenas H

– 300 tipos de V-kappa x 4 tipos de J-kappa = 1.2·103 tipos de cadenas kappa

– 2 tipos funcionales de V-lmabda x 3 tipos de J-lambda = 6 tipos de cadenas lambda.

Aunque las secuencias señalizadoras de la recombinación (RSS) se empalman siempre de modo preciso, la unión de dos segmentos codificadores a menudo es imprecisa (por eso se habla de flexibilidad), pudiendo generar reordenaciones no productivas (teóricamente 2/3 de las veces), pero también productivas, en las que aparecen aminoácidos alternativos en la juntura. Ello implica que se incrementa la diversidad de especificidades de anticuerpos, a nivel de la CDR3, tanto de cadenas ligeras como pesadas. Por término medio, cada unión VLDL, DHJH y VHDH puede producir tres aminoácidos distintos (Recombinación variable). 300 tipos de VH x 13 tipos de DH x 4 tipos. Por lo tanto:

– Cadenas H: 3×3 = 9 (casi un orden de magnitud de aumento para las cadenas pesadas) .

– Cadenas kappa: factor 3 de aumento de variabilidad.

– Cadenas lambda: factor 3 de aumento de variabilidad.

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6.1.3.3. DIVERSIFICACIÓN DE LA REGIÓN AMINOTERMINAL (RECOMBINACIÓN VARIABLE).

A nivel del polipéptido, las zonas de unión DHJH y VHDH contienen algunos aminoácidos no tienen una codificación genética propiamente dicha (no están codificados en los respectivos segmentos D, J y V) sino que vienen determinados por los llamados nucleótidos N, que se adicionan ex-profeso durante la fase de unión D-J y V-DJ.

La reacción viene catalizada por la desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) con actividad ADN-polimerasa independiente de molde, que va añadiendo aleatoriamente hasta 15 nucleótidos en las junturas, de modo que la región final la podemos representar así: VH -N-DH-N-JH. Esto aporta una diversidad adicional bastante grande que afecta exclusivamente a la CDR3 de la cadena pesada.

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6.1.3.4. COMBINACIÓN DE CADENAS PROTEICAS H y L.

También contribuye a la diversidad porque la región V de cada cadena participa en el reconocimiento antigénico.

6.1.3.5. HIPERMUTACIÓN SOMÁTICA.

Después de una estimulación antigénica, los linfocitos B contactan con el antígeno y migran a los folículos linfoides para crear los centros germinales, se produce el fenómeno conocido como hipermutación somática. En este proceso, los genes de las cadenas ligeras y pesadas sufren una hipermutación somática que afectan principalmente a los genes de las cadenas V y son responsables de la maduración de la afinidad del Ac durante la respuesta secundaria. Los principales lugares donde tienen lugar las mutaciones somáticas son los centros germinales de los folículos linfoides secundarios en respuesta a antígenos dependientes de LTh.

Se conocen ciertas características de las mutaciones somáticas que tienen lugar en los genes de las Ig:

Las mutaciones afectan principalmente a la IgG y la IgA, en un fenómeno asociado al cambio de clase de Ig. Es presumible que las variantes somáticas sean seleccionadas por el Ag, por tener mayor afinidad que los Ac de la línea germinal.

– Hay una altísima tasa de mutación (10-3·pb-1·generación-1, es decir, un millón de veces más que la normal) que va generando continuamente nuevas variantes de inmunoglobulinas a partir de la reordenación génica original.

– El número de mutaciones se va incrementando durante la respuesta inmune, sobre todo en la respuesta secundaria y ulteriores.

– Conforme aumenta la edad del individuo aumentan las mutaciones, lo cual parece que se debe a que existen más células B de memoria que van entrando en el proceso de hipermutación somática.

Las mutaciones puntuales tienden a agruparse en los exones de las regiones V y en las secuencias flanqueantes de las cadenas H y L, y son más numerosas en las regiones hipervariables (CDR1 y CDR2).

– Las mutaciones más frecuentes son transiciones que llevan a sustituciones en la secuencia de aminoácidos de las CDR. El resultado es que aparecen nuevas variantes de Ig a partir de la original.

– Las mutaciones pueden conducir a un Ac que no reconozca el Ag, y el LB puede morir o adquirir una nueva especificidad para otro Ag.

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