Métodos para cuantificar la carga viral del VIH

1. RESUMEN DE LAS CARACTERÍSTICAS TÉCNICAS.

Actualmente existen diversas técnicas disponibles que permiten la detección de la carga vírica plasmática. Las diferencias fundamentales radican en los formatos, tiempos y capacidad de procesamiento. Todas las técnicas detectan y cuantifican el subtipo mayoritario B y algunos otros subtipos circulantes (A, C, D, F, G), y solamente la técnica de RT-PCR de Abbott cuantifica el grupo O. Ninguna de las técnicas detecta el VIH-2.

Hay diversos métodos para poder medir en plasma la carga vírica del VIH-1 y cada uno de ellos tiene un diseño diferente:

Tabla 1: Características principales de las técnicas disponibles para la detección de la CVP.

PARÁMETROS

AMPLICOR HIV-1 MONITOR

COBAS TAQMAN HIV-1

ABBOTT REAL TIME

NUCLISENS EasyQ HIV-1

VERSANT HIV-1 RNA 3.0

Método aplicado

RT-PCR

RT-PCR a tiempo real

RT-PCR a tiempo real

NASBA

bDNA

Rango dinámico del método

400-750.000 copias/ml

48-107 copias/ml

40-107 copias/ml

25-3.000.000 UI/mL

75-500.000 copias/ml

Detección de los subtipos de VIH-1 del grupo M

B

A-G

A-H

A-G

A-G

Detección del VIH-2

No

No

No

No

No

Detección VIH-1 grupo O

No

No

Si*

No

No

Método de detección

Colorimetría (peroxidasa)

Fluorescencia

(Sondas de hibridación)

Fluorescencia

(Sondas de hibridación)

Fluorescencia (molecular beacons)

Quimioluminiscencia

(fosfatasa)

Extracción Automática

Si

Si

Si

Si

No

*También detecta el grupo N.

2. RT-PCR (Amplicor Monitor, Roche)

2.1.- PRINCIPIO DEL ENSAYO

Esta prueba se basa en cinco procesos fundamentales:

a) Extracción de ARN.

b) Transcripción del ARN diana para generar ADN complementario.

c) Amplificación por PCR de éste ADNc con iniciadores específicos.

d) Hibridación de los productos amplificados con sondas oligonucleotídicas, específicas para las dianas.

e) Detección por colorimetría de los productos amplificados y unidos a las sondas.

En la prueba AMPLICOR para HIV 1, la transcripción inversa y amplificación de ARN del HIV-1 y del patrón de cuantificación se realizan de forma simultánea. La mezcla maestra contiene pares de iniciadores biotinilados específicos para el ácido nucleico diana y el patrón de cuantificación.

La cuantificación de ARN del HIV-1 se determina con ayuda del llamado patrón de cuantificación, una transcripción no infecciosa de ARN obtenida in vitro, con regiones de fijación a los iniciadores idénticas a las de la secuencia diana del HIV-1 y una región única de fijación a las sondas que permiten diferenciar el amplicón (producto de la amplificación por PCR) del patrón de cuantificación y el amplicón de HIV-1 . El patrón de cuantificación se incorpora a cada muestra con una cantidad conocida y atraviesa junto con el ARN diana del HIV-1 las fases de preparación de las muestras, transcripción inversa, amplificación por PCR, hibridación y detección. Los niveles de ARN del HIV-1 en las muestras analizadas se determinan mediante comparación entre la absorbancia obtenida del patrón de cuantificación y la absorbancia del VIH en cada muestra. Así pues el patrón de cuantificación compensa cualquier efecto inhibitorio y garantiza la precisión de la cuantificación del proceso de amplificación para cada muestra.

2.1.1. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA.

El ARN del HIV-1 se aísla a partir del plasma mediante lisis de las partículas víricas con un agente caotrópico y precipitación del ARN con alcohol. Con el reactivo de lisis se introduce en cada muestra un número conocido de moléculas de ARN del patrón de cuantificación. Este patrón, que atraviesa las fases de preparación, amplificación y detección, sirve para cuantificar el ARN del HIV-1 en la muestra analizada.

Actualmente existen sistemas automáticos de extracción de ácidos nucleicos (Cobas AmpliPrep (Roche), NucliSens EasyMag (Biomerieux), EZ1 Advanced (Qiagen)) que permiten una mejor estandarización de este proceso.

2.1.2. TRANSCRIPCIÓN Y AMPLIFICACIÓN POR PCR.

Esta prueba amplifica y detecta un secuencia diana de 142 bases, localizadas en una región muy conservada del gen “gag” del HIV-1 y definida por los iniciadores SK431 y SK462, que están biotinilados en el extremo 5’. La región “gag” codifica antígenos específicos de grupo (proteínas estructurales centrales del virión).

La reacción de amplificación se lleva a cabo por medio de la enzima polimerasa rTth (ADN-polimerasa termoestable de “Thermus thermophilus”, obtenida por ingeniería genética). En presencia de manganeso y en las condiciones de tampón adecuadas, esta polimerasa posee una doble actividad como transcriptasa inversa y ADN-polimerasa.

a) Transcripción inversa.

Las muestras ya preparadas se añaden a la mezcla de amplificación en los tubos de reacción, en los que tiene lugar la transcripción inversa y la amplificación por PCR. La mezcla reactiva se calienta para que el iniciador ascendente se hibride de forma específica con el ARN del HIV-1 y el patrón de cuantificación. En presencia de un exceso de nucleótidos trifosfato (dNTP) la rTth elonga el iniciador hibridado y sintetiza una hebra de DNA complementario (DNAc).

b) Amplificación por PCR.

En esta fase se calienta la mezcla reactiva para desnaturalizar el híbrido ADNc/ARN y exponer las secuencias diana a los iniciadores. Cuando se produce la hibridación con el iniciador descendente, la rTth cataliza la reacción de elongación y se sintetiza así una cadena de ADN. Termina el primer ciclo de PCR, con la obtención de una copia bicatenaria de ADNc de la región diana para cada ARN del HIV-1 o el patrón de cuantificación. Estos ciclos se repiten un número determinado de veces, duplicándose cada vez la cantidad de amplicón. No se amplifica todo el genoma del HIV-1, sino solo la región comprendida entre ambos iniciadores.

El empleo de AmpErase y dUTP permite conseguir una amplificación selectiva del ácido nucleico diana a partir de la muestra clínica. AmpErase contiene la enzima uracilo-N-glucosilasa (UNG), que reconoce y cataliza la destrucción de las moléculas de ADN que contienen desoxiuridina, pero no las que contienen timidina. El ADN natural carece de desoxiuridina, que sin embargo está siempre presente en los amplicones, debido al empleo de dUTP como uno de los dNTP en la mezcla maestra. La presencia de AmpErase permite destruir al ADN contaminante antes de iniciar la amplificación del ADN diana. AmpErase es inactivo por encima de 55 ºC, esto es, durante los siguientes pasos del ciclo térmico, de modo que no destruye los amplicones diana.

2.1.3. HIBRIDACIÓN.

Una vez efectuada la amplificación por PCR, los amplicones de HIV-1 y el patrón de cuantificación se desnaturalizan químicamente a ADN monocatenario mediante adición de la solución de desnaturalización; a continuación se transfieren a los pocillos de una microplaca, cubiertos con sondas oligonucleotídicas específicas para el HIV-1 (SK102) y el patrón de cuantificación (CP35). Los amplicones del HIV-1 y el patrón de cuantificación se unen a los pocillos correspondientes mediante hibridación con las sondas de la microplaca. En la microplaca se analizan diluciones seriadas de los amplicones desnaturalizados, con el fin de conseguir resultados cuantitativos dentro de un amplio intervalo dinámico.

2.1.4. DETECCIÓN.

Después de la reacción de hibridación, se lava la microplaca para eliminar el material no fijado y se añade a cada pocillo un conjugado de avidina y peroxidasa de rábano picante (conjugado Av-HRP). El conjugado Av-HRP se une a los amplicones marcados con biotina y capturados por las sondas oligonucleotídicas ligadas a la microplaca. A continuación, se lava de nuevo la microplaca para eliminar el conjugado no ligado y se añade a cada pocillo una solución de sustrato que contiene peróxido de hidrógeno y TMB, catalizándose la oxidación de TMB para formar un complejo coloreado. Por último, se añade un ácido débil para detener la reacción y se determina la densidad óptica a 450 nm en un lector automático de microplacas.

2.2. CUANTIFICACIÓN DEL ARN DEL HIV-1.

Este kit permite cuantificar la cantidad de virus presente en la muestra con ayuda de una segunda secuencia diana (el patrón de cuantificación) que se añade a la muestra en una cantidad conocida. Este patrón de cuantificación es una molécula no infecciosa de ARN, transcrita in vitro, con 219 pb y regiones de fijación a los iniciadores idénticas a las de una secuencia diana del HIV-1, generando un producto de idéntica longitud y con la misma composición de base que HIV-1. Ahora bien, su región de fijación a las sondas se ha modificado, con el fin de poder modificar el amplicón específico del patrón de cuantificación y el amplicón diana del HIV-1.

La densidad óptica (DO) en cada pocillo de la microplaca es proporcional a la cantidad de amplicón de HIV-1 o el patrón de cuantificación (PC) presente en el pocillo; la densidad óptica total es proporcional a la cantidad de ARN presente en cada reacción de transcripción inversa y amplificación por PCR. La cantidad de ARN del HIV-1 en cada muestra se calcula a partir del cociente entre la densidad óptica total para el HIV-1 y la densidad óptica total para el patrón de cuantificación, multiplicado por el número de moléculas de patrón de cuantificación introducidas, de acuerdo con la siguiente ecuación:

Total HIV-1 DO

———————— x Input QS copias/ml por reacción PCR x 40 = HIV-1 RNA copias/ml

Total QS DO

3. RT-PCR en tiempo real (COBAS TAQMAN, Roche Diagnostics; ABBOTT REAL TIME, Abbott).

La RT-PCR en tiempo-real se basa en los mismos principios que la RT-PCR convencional, excepto en la detección del producto amplificado. Para ello se emplean sondas fluorescentes específicas que se unen al producto de la reacción emitiendo fluorescencia medible y proporcional a la cantidad de RNA de HIV-1 presente en la muestra de plasma. Esta técnica se denomina a tiempo real ya que la hibridación se va produciendo simultáneamente a la formación del producto, y los termocicladores termocicladores incorporan un lector de fluorescencia que detecta el producto a medida que se va formando.

Existen múltiples formatos de sondas específicas, siendo las más frecuentemente utilizadas las sondas Taqman (Roche Diagnostics Corporation), FRET (“Fluorescent resonance energy transfer”) (Roche Molecular Biochemicals) y “molecular beacons”. Las sondas Taqman son oligonucleótidos marcados en el extremo 5´ con la molécula fluorescente que va a ser medida y que es liberada debido a la actividad 5´ exonucleasa de la Taq DNA polimerasa durante la reacción de PCR. En las sondas con formato “beacon” la liberación del fluoróforo a medir se produce por un cambio conformacional durante la hibridación de la sonda con su diana. El formato de sondas FRET comprende 2 oligonucleótidos, uno de ellos marcado con fluoresceína en el extremo 3´ y el otro marcado con otro fluoróforo (normalmente LCRed 640) en el extremo 5´. La separación entre ambas sondas debe ser menor de 5 nucleótidos, para que se pueda producir, tras la excitación de la fluoresceína por la fuente de luz del instrumento, la transferencia de energía a la 2ª sonda que emite la fluorescencia que será cuantificada y que es proporcional a la cantidad de DNA generado durante la amplificación.

Esta modificación en la metodología de la RT-PCR ha supuesto una mejora en la rapidez del proceso, disminuye el riesgo de contaminación al producirse en la reacción completa en un recipiente cerrado y un aumento en la sensibilidad de las técnicas, alcanzando un rango dinámico entre 40-107copias/mL.

Figura 2: Sondas específicas Taqman, molecular beacons y sondas FRET.

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4. AMPLIFICACIÓN ISOTÉRMICA DE ARN O NASBA (NucliSENS EasyQ® HIV-1 v. 1.2, Biomerieux)

Las secuencias de ácidos nucleicos diana se pueden amplificar exponencialmente en condiciones isotérmicas (41ºC) usando tres actividades enzimáticas: transcriptasa inversa, RNasa H, y una polimerasa ARN dependiente de ADN. Esta estrategia mimetiza el ciclo de replicación retroviral del ARN a través de un ADNc intermedio y el resultado de esta reacción es la acumulación de copias de ADNc y ARNss de las secuencias diana. La reacción intermedia con la hibridación de uno de los oligonucleótidos, contiene una extensión de una secuencia promotora T7, para el ARN, seguida de elongación del oligonucleótido por la actividad enzimática de la transcriptasa inversa. Entonces la cadena de ARN de la hibridación ARN-ADN es degradada por la actividad RNasa H, y se produce el anillamiento del segundo oligonucleótido a la cadena sencilla de ADNc. A continuación se sintetiza una segunda cadena de ADN por la actividad ADN polimerasa de la transcriptasa inversa, dando lugar a una doble cadena de ADN que incluye el promotor T7 ARN polimerasa. El T7 ARN polimerasa puede producir 1×102-1×103 copias de ARN de cada cadena doble de ADN. Cada molécula de ARN sintetizada se puede usar como diana en una nueva fase de hibridación de ADNc y subsiguiente síntesis de ARN. Durante el proceso hay una acumulación mayor de ARN específico y una menor extensión de los híbridos ARN-ADN y doble cadena de ADN. El método puede usar cadenas de ARN como dianas, mientras que la amplificación de ADN requiere un paso de desnaturalización inicial por calor para facilitar un primer anillamiento.

Figura 3: Esquema del proceso de amplificación isotérmica del RNA o NASBA NucliSENS EasyQ® HIV-1 v. 1.2, Biomerieux.

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4.1. DETECCIÓN DEL ÁCIDO NUCLEICO.

La detección de las moléculas de ARN de una sola hebra se realiza mediante sondas específicas del tipo “molecular beacons”, que consiste en un oligonucleótido con forma de horquilla marcado con una molécula fluorescente en un extremo y un “quencher” o apantallador en el otro. La secuencia de la sonda es específica y complementaria a la secuencia diana. Al unirse las secuencias complementarias la horquilla se abre y el “quencher” se separa del fluoróforo, permitiendo la emisión de fluorescencia.

Figura 4: Esquema del sistema de detección de RNA NucliSENS EasyQ® HIV-1 v. 1.2, Biomerieux

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5. AMPLIFICACIÓN DE SEÑAL POR HIBRIDACIÓN MOLECULAR O bDNA (VERSANT HIV-1 RNA 3.0 Assay, Bayer).

El “branched” DNA (bDNA) o ADN ramificado (ADNr) es una técnica relativamente reciente (Urdea, 1993), basada en la amplificación de señal que implica una serie de hibridaciones de ácidos nucleicos en la superficie del pocillo de una microplaca, método análogo a un EIA. Con este método se pueden detectar hasta un mínimo de 500 partículas virales. Para conseguir esto, es necesario unir alrededor de 500 moléculas “señal” a cada virus.

La técnica de ADNr se basa en la amplificación de señales detectadas (CUANTIFICACIÓN DIRECTA) y no en la amplificación de secuencias diana. Tras una ultracentrifugación que concentra el HIV-1 en la muestra de plasma, y la liberación del RNA del virión, las cadenas sencillas de RNA se hibridan con una mezcla de sondas de captura (n=17) que están fijadas en los pocillos de una microplaca. A continuación se añade una mezcla de sondas diana (n=81) que hibridan con el RNA viral en diferentes regiones del gen “pol”, y también van a hibridar con las sondas amplificadoras (oligonucleótidos ramificados de ADN), formando el complejo ramificado bDNA. Finalmente múltiples copias de sondas marcadas enzimáticamente con fosfatasa alcalina se unen a las moléculas ramificadas de ADN, y para la detección se añade un sustrato quimioluminiscente apropiado. La detección del ADN amplificado se hace por un método luminiscente y se expresa en unidades relativas de luz (RLUs).

Figura 5: Esquema del sistema de amplificación de señal por hibridación molecular o bDNA VERSANT HIV-1 RNA 3.0 Assay, Bayer

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