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La proteasa del VIH como blanco de la terapia antiviral

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Proteasa del VIH:

Aspartil proteasas, también conocido como ácido proteasas, son una amplia subfamilia de enzimas proteolíticas que pertenecen a la familia de enzimas endonucleasas. La subfamilia de las aspartil proteasas se caracteriza por tener muy conservadas la secuencia Asp -Gly-Thr. Aspartate proteases in general, with the exception of HIV which is a dimer of two identical subunits, are found as monomeric enzymes consisting of two domains hiv1pro.htm ( 11 ). 5

Las Proteasas (Proteinasas, Peptidasas o enzimas Proteolíticas) son enzimas que rompen los enlaces péptidos entre los aminoácidos de las proteínas. Este proceso se llama corte proteolítico, un mecanismo común de activación y desactivación de enzimas especialmente involucradas en la coagulación de la sangre o digestión. Utilizan una molécula de agua para eso y así son clasificadas como hidrolasas.

Actualmente hay seis clases de proteasas:

  • Proteasas de serina
  • Proteasas de treonina
  • Proteasas de cisteína
  • Proteasas de ácido aspártico
  • Metaloproteasas
  • Proteasas de ácido glutámico

Estas enzimas están involucradas en una multitud de reacciones fisiológicas desde la digestión simple de las proteínas alimenticias hasta procesos muy regulados (ej. la cascada de la coagulación de la sangre, el sistema complemento, las vías de apoptosis, y  la cascada invertebrada que activa prophenoloxidase). Las Peptidasas pueden descomponer enlaces péptidos específicos (proteolísis limitada), dependiendo de la secuencia de aminoácidos de una proteína, o descomponer un péptido completo en aminoácidos (proteolísis ilimitada). La actividad puede ser un cambio destructor suprimiendo la función de una proteína o digiriéndola a sus componentes principales; puede ser la activación de una función o puede ser una señal en una vía de señalización.

Los enlaces péptidos divididos por  Proteasa con agua, atacan las proteínas de dos modos, produciendo productos distintos. Por lo tanto, su elección de la enzima puede estar dictada por lo que se requiera como producto hidrólisis.

En el modo de ataque, las proteasas son clasificadas en:

  1. Exoproteasa:
    Son proteasas que pueden cortar aminoácidos solos de cualquier extremo de la cadena de proteína.  Finalmente bajo condiciones adecuadas una proteína puede ser reducida a un sólo aminoácido.
  1. Endoproteasas:
    Son proteasas que atacan los enlaces peptídicos en el interior de la cadena de proteína.  Los productos de hidrólisis son normalmente polipéptidos menores .Por lo tanto la mayoría de las endoproteasas no producirán una gran cantidad de aminoácidos libres como producto final.

Especificidad:
Hay muchas proteasas distintas, cada una con una especificidad distinta hacía las proteínas sustratos.

Aplicaciones:

  • Las proteasas son enzimas comercialmente importantes, tienen una aplicación industrial amplia;
  • La mayor utilidad industrial de la proteasa es para los detergentes para las lavanderías en donde ayudan a quitar las manchas basadas en la proteína (como la sangre y el huevo) de la ropa.
  • La segunda mayor utilidad de la proteasa es para la fabricación de queso. Las enzimas del estómago de la ternera y las fuentes microbianas se usan para coagular la leche como primer paso en la fabricación de queso.
  • Las proteasas también se usan para ablandar la piel, para modificar los ingredientes de los alimentos, ablandadores de carne, y desarrollo de sabores.
  • Las proteasas también han sido estudiadas por su papel en la coagulación de la sangre y en las enfermedades inflamatorias. 5,6,7,8

Proteasa del VIH

La Proteasa del VIH contiene residuos de ácido aspártico apareados, se localizan en el "suelo" del sitio activo del enzima (Asp25, Asp125 [algunas veces denominados como Asp25']). Además, el complejo enzima-substrato también contiene una molécula muy importante de agua en su estructura, la cual está interpuesta entre el substrato y las zonas flexibles del enzima (el agua contacta los residuos  Ile50 y  Ile150 [algunas veces designados como   Ile50']).del VIH PR. Esta molécula de agua es única en las proteasas retrovirales comparadas a otras proteasas de ácido aspártico. Por eso algunos de los inhibidores de las proteasas buscan a ésta molécula de agua. Entre éstos inhibidores están los grupos químicos que imitan las propiedades de la unión hidrógeno de la molécula de agua, y la excluyen del  sitio activo del enzima.9

La proteasa del VIH es una enzima codificada por uno de los nueve genes conocidos del VIH, el gen pol. Este gen codifica una proteína de 99 aminoácidos y para ser funcional tienen que unirse dos moléculas iguales de 99 aminoácidos para componer la proteasa propiamente dicha, es decir es una molécula homodimérica. Una proteína aislada de 99 aminoácidos es una molécula inactiva. Esta enzima actúa sobre dos proteínas virales precursoras o poliproteinas, las poliproteinas Gag y Gag – Pol.10 El rompimiento de la proteína Gag produce tres proteínas mayores: p24, p17 y p7 que conforman parte del core – corazón – o centro del virus, y tres proteínas pequeñas: p6, p2 y p1 con actividad funcional durante el proceso de exportación viral. La actividad enzimática sobre la poliproteina Gag – Pol produce las proteínas con actividad enzimática ampliamente conocidas: transcriptasa reversa, integrasa y la misma proteasa. 11

La proteasa actúa durante las etapas tardías o avanzadas de la replicación viral, cundo la nueva partícula viral está saliendo de la célula o poco después de su salida.6, 7

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Mecanismo catalítico

El Mecanismo catalítico consiste en la polarización del enlace peptídico por el ataque nucleofílico sobre el enlace carbono oxigeno y la donación paralela de un protón al átomo de nitrógeno.

El sustrato está anclado en las inmediaciones del centro activo de la enzima como consecuencia de los enlaces de hidrogeno que se establecen entre los restos de glicina y de isoleucina próximos al centro activo y a los grupos carbonilos contiguos al enlace hidrolizable. La estabilización a través de los restos de isoleucina requiere la participación de una molécula de agua adicional. En la etapa de hidrólisis del enlace peptídico, dos restos de aspartato actúan como base arrancando un protón de la molécula de agua, estabilizando la especie tetraédrica que se desarrolla durante el estado de transición de la reacción.6, 7

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INHIBICIÓN ENZIMÁTICA

Inhibidor:

Efector que hace disminuir la actividad enzimática, a través de interacciones con el centro activo u otros centros específicos (alostérico).

Esta definición excluye todos aquellos agentes que inactivan a la enzima a través de desnaturalización de la molécula enzimática.12, 13

Los inhibidores enzimáticos también son usados en la naturaleza y están implicados en la regulación del metabolismo. Por ejemplo, las enzimas pueden ser inhibidas por los productos resultantes de sus respectivas vías. Este tipo de contrarreacción retarda el flujo a través de la vía cuando los productos comienzan a acumularse y es una manera importante de mantener la homeostasis en una célula. Otros inhibidores enzimáticos celulares son proteínas que se unen específicamente e inhibe a su enzima blanco. Esto puede ayudar a controlar enzimas que pueden ser dañinas para la célula, como las proteasas o nucleasas; un buen ejemplo es el inhibidor de la ribonucleasa, que se une a esta enzima en una de las interacciones proteína–proteína más fuertes conocidas. Inhibidores enzimáticos naturales también pueden ser venenos y ser usados como defensa en contra de depredadores o una forma de matar a la presa.6, 7

La actividad enzimática puede ser disminuida o eliminada por la acción de ciertas sustancias a las cuales se les conoce con el nombre de inhibidores enzimáticos. Mediante el uso de inhibidores enzimáticos se ha obtenido información muy valiosa sobre la conformación del centro activo de algunas enzimas.13

Tipos de inhibidores

De esta forma, habrá dos tipos de inhibidores:

· Isostéricos: ejercen su acción sobre el centro activo

· Alostéricos: ejercen su acción sobre otra parte de la molécula, causando un cambio conformacional con repercusión negativa en la actividad enzimática.

Los inhibidores Isostéricos pueden ser de dos tipos:

1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre, con el complejo enzima-substrato o con ambos:

a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, impidiendo la fijación del substrato: Inhibición Competitiva

b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, no impide la fijación del substrato a la enzima, pero sí impide la acción catalítica: Inhibición No Competitiva

c) El inhibidor se fija únicamente al complejo enzima-substrato una vez formado, impidiendo la acción catalítica; este tipo se conoce como Inhibición Acompetitiva.

Los inhibidores reversibles se unen a la enzima con interacciones no covalentes tales como los puentes de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas y enlaces iónicos. Los enlaces débiles múltiples entre el inhibidor y el sitio activo se combinan para producir una unión fuerte y específica. Al contrario de lo que ocurre con el sustrato y los inhibidores irreversibles, los inhibidores reversibles generalmente no experimentan reacciones químicas cuando se unen a la enzima y pueden ser removidos fácilmente por dilución o diálisis.

  • En la inhibición competitiva, el sustrato y el inhibidor no se pueden unir a la misma enzima al mismo tiempo, como es mostrado en la siguiente figura. Esto generalmente ocurre cuando el inhibidor tiene afinidad por el sitio activo de una enzima donde el sustrato también se une; el sustrato y el inhibidor compiten para el acceso al sitio activo de la enzima. Este tipo de inhibición se puede superar con concentraciones suficientemente altas del sustrato, es decir, dejando fuera de competición al inhibidor. Los inhibidores competitivos son a menudo similares en estructura al sustrato verdadero.

Inhibición competitiva: el sustrato (S) y el inhibidor (I) compiten por el sitio activo.

  • En la inhibición mixta, el inhibidor se puede unir a la enzima al mismo tiempo que al sustrato de la enzima. Sin embargo, la unión del inhibidor afecta la unión del substrato, y viceversa. Este tipo de inhibición se puede reducir, pero no superar al aumentar las concentraciones del sustrato. Aunque es posible que los inhibidores de tipo mixto se unan en el sitio activo, este tipo de inhibición resulta generalmente de un efecto alostérico donde el inhibidor se une a otro sitio que no es el sitio activo en una enzima. La unión del inhibidor con el sitio alostérico cambia la conformación (es decir, la estructura terciaria o la forma tridimensional) de la enzima de modo que la afinidad del sustrato por el sitio activo se reduce.
  • La inhibición no competitiva es una forma de inhibición mixta donde la unión del inhibidor con la enzima reduce su actividad pero no afecta la unión con el sustrato. Como resultado, el grado de la inhibición depende solamente de la concentración del inhibidor

Inhibidores irreversibles

2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima:

Y por lo tanto la inhibición no puede ser invertida. Los inhibidores irreversibles comúnmente contienen grupos funcionales reactivos. Estos grupos reaccionan con las cadenas de aminoácidos para formar uniones covalentes. Los residuos modificados son esos que contienen en sus cadenas laterales un grupo hidroxilo o un grupo sulfhídrico; esto incluye a los aminoácidos serina, cisteína, treonina y tirosina.

Son generalmente específicos para un tipo de enzima y no inactivan a todas las proteínas; estos no funcionan destruyendo la estructura proteínica, pero específicamente alterando el sitio activo de su blanco.

La mayoría de los inhibidores enzimáticos de la proteasa del VIH son compuestos que imitan la configuración del estado transicional del substrato natural del VIH PR.  Como consecuencia, los inhibidores se unen al enzima más fuertemente que el substrato natural (ya que el substrato debe distorsionarse para asumir la configuración de estado de transición). Estos compuestos son por lo tanto, inhibidores enzimáticos competitivos, y se clasifican de acuerdo a la simetría de sus estructuras.

El conocimiento de la estructura tridimensional de la enzima ha permitido la aplicación de técnicas de modelización molecular en el diseño de inhibidores selectivos. La mayor parte de los inhibidores de la proteasa del VIH desarrollados hasta la fecha se basan en análogos del estado de transición de la etapa de hidrólisis.

La inhibición de la proteasa del VIH fue uno de los primeros objetivos en el tratamiento del SIDA, habiéndose desarrollado varios fármacos que inhiben la acción de la enzima: los inhibidores de la Proteasa (IP) 14,15

Inhibidores de la Proteasa del VIH

En la segunda mitad de la década de los años noventa, se incorporaron los inhibidores de la proteasa (IP) como fármacos antirretrovirales para el tratamiento de la infección causada por el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1). Esta novedad terapéutica generó un descenso importante en la morbilidad y mortalidad provocada por el SIDA, reflejándose en una reducción de la incidencia de infecciones oportunistas y de ingresos hospitalarios, aumentando la calidad de vida del paciente VIH positivo.10

El mecanismo de acción de los IP está basado en el bloqueo de la acción de la enzima proteasa del VIH que está formada por 2 monómeros estructuralmente idénticos que se ensamblan para formar la región catalítica inhibida por estos fármacos.10, 11,14

En 1997 el Consejo Asesor Clínico del Plan Nacional sobre el SIDA estableció unas recomendaciones para abordar el tratamiento farmacológico antirretroviral.

A los pacientes sin tratamiento previo, se les debía administrar una combinación triple de dos inhibidores de la transcriptasa inversa nucleosídicos (ITIN) más un IP, como tratamiento inicial estándar. En el año 2000 el Departamento de Salud y Servicios Humanos (DHHS) de EE.UU., como tratamiento de primera línea en la infección por el VIH, recomienda saquinavir + ritonavir (IP),Indinavir (IP), nelfinavir (IP) o efavirenz (ITIN no nucleosídico = ITINN) asociado a dos ITIN.

Los IP son más efectivos en la supresión del VIH cuando son administrados en combinación con ITIN y/o no nucleosídicos (ITINN) si se compara con las primeras pautas que incluían uno o dos fármacos. Los estudios clínicos realizados han demostrado que la terapia triple antirretroviral en la que se incluye un IP produce una disminución de la carga viral por debajo de las concentraciones plasmáticas mínimas detectables en un número elevado de pacientes (50-90% en función del IP administrado) y durante periodos largos de tiempo (de 9 a 24 meses).

Mecanismo de acción de los IP

Los IP son fármacos que presentan una estructura peptídica análoga al sustrato natural con el que compiten, a excepción del nelfinavir que es un IP sintético no peptídico. Según su estructura se agrupan en: compuestos miméticos de estado transicional: saquinavir (SQV), indinavir

(IDV) y nelfinavir (NFV), o pseudosimétricos o simétricos C2, como es el caso del ritonavir (RTV). Su mecanismo de acción se basa en competir con el sustrato natural -poliproteína vírica- por el centro catalítico de la proteasa, impidiendo la escisión de las proteínas gag y gap-pol, originando la formación de viriones inmaduros no infecciosos con la interrupción posterior de la diseminación del virus.14

Inhibidores Peptidomiméticos

En este caso los grupos isosteros del enlace peptídico que han resultado más eficaces son el hidroxietileno y la hidroxietilamina .Estos grupos serian capaces de mimetizar la ordenación tetraédrica del estado de transición generado en la hidrólisis del enlace peptídico. Ejemplos: indinavir, saquinavir, ritonavir.

Estos inhibidores, administrados junto con inhibidores de la transcriptasa reversa del VIH, en forma de asociaciones que reciben el nombre genérico “cocteles de fármacos”, representan la aproximación más eficaz de que se dispone hoy día para el tratamiento y control del SIDA.

Inhibidores de naturaleza no peptídica.

Con el objeto de paliar la baja biodisponibilidad oral que presentan algunos peptidomiméticos indicados anteriormente, se han dedicado numerosos esfuerzos al desarrollo de inhibidores de naturaleza no peptídica y selectivos de la proteasa del VIH. En este sentido el conocimiento de la estructura dímera simétrica de la proteasa VIH ha permitido el diseño de nuevos inhibidores basados en su capacidad para interaccionar de forma complementaria con el centro activo de la enzima. Ello ha conducido a inhibidores caracterizados por poseer elementos de simetría equivalentes a los de la enzima (un eje de simetría C2) Un ejemplo lo constituyen los análogos del estado de transición derivados de las ureas cíclicas . En esta familia de compuestos, el grupo carbonilo del sistema heterocíclico desempeña el papel de la molécula de agua ubicada entre los restos de Ile50 y Ile50’ y los grupos hidroxilos interaccionan con los restos de Asp25 y Asp25’ del centro activo de la enzima. Esta situación es análoga a la que se produce en el estado de transición de la reacción de hidrólisis.10,

Agentes Inhibidores de Proteasa y su Historia de Aprobación por la FDA

· Saquinavir (Invirase) Diciembre 6, 1995

· Ritonavir (Norvir) Marzo 1, 1996

· Indinavir (Crixivan), Marzo 13, 1996

· Nelfinavir (Viracept) Marzo 14, 1997

· Saquinavir (Fortovase) Noviembre 7, 1997

· Amprenavir (Agenerase) Abril 15, 1999

· Lopinavir/Ritonavir (Kaletra) Septiembre15, 2000

· Atazanavir (Reyataz) Junio 20, 2003

· Fosamprenavir (Lexiva) Octubre 20, 2003

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MECANISMOS DE RESISTENCIA

La resistencia a los fármacos antirretrovirales se produce, generalmente, como resultado de la selección de mutaciones en el genoma de un virus salvaje, generando variantes del VIH capaces de replicar eficientemente en presencia de un determinado inhibidor. 16

RESISTENCIA A LOS INHIBIDORES DE PROTEASA

Se produce como consecuencia de cambios en ciertos aminoácidos, que se seleccionan, tanto en el dominio de unión del sustrato, como en lugares distantes a este dominio .La selección de virus mutantes resistentes a los IP origina cambios estructurales en los sitios de corte de la proteasa, reduciendo la afinidad de unión por el inhibidor. Los efectos causados por otras mutaciones, que se seleccionan en áreas diferentes al lugar activo de la proteasa, son menos obvios, pero podrían alterar la actividad catalítica de la enzima, la estabilidad estructural del dímero, la cinética de unión del inhibidor, o bien producir cambios estructurales en el lugar activo de la proteasa a través de perturbaciones producidas en otras áreas alejadas del centro activo.

Directa o indirectamente, estas mutaciones modifican tanto en el número como la naturaleza de los puntos de contacto entre los inhibidores y la proteasa, reduciendo así la afinidad por la enzima.

Se han detectado más de 87 mutaciones asociadas a resistencia en al menos 47 posiciones de la proteasa del VIH. Según se localicen las mutaciones, fuera o dentro del lugar activo de la proteasa, éstas se clasifican en mutaciones del sitio activo o mutaciones externas al sitio activo.15, 16

Bibliografía

1 Manual del Sida 5ª edición 2003. Soriano Vázquez V, González-Lahoz J.Publicaciones Permanyer.689 páginas

2 Harrison´s Principles of Internal Medicine. Fauci AS editor, et al. 1997. Fourteenth Edition. The McGraw-Hill Companies, Inc.

3 Apuntes curso de infectología, V año. 2000.

4 Pérez S., Lautaro. Biología molecular del virus de la inmunodeficiencia humana y los recientes progresos en el tratamiento del SIDA. Rev. chil. pediatr. [online]. mar. 2000, vol.71, no.2 [citado 27 Junio 2008], p.83-88. Disponible en la World Wide Web: http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0370-41062000000200002&lng=es&nrm=iso. ISSN 0370-4106.

5 Ala PJ, Huston EE, Klabe RM, McCabeDD, Duke JL, et al. 1997. Molecular basisof HIV-1 protease drug resistance: structural analysis of mutant proteases complexed with cyclic urea inhibitors. Biochemistry 36:1573–80

6 GARRET RH & GRISHAM CM. Biochemistry 2ª Ed. Thomson-Brooks-Cole. (2006).

7 Lehninger, A.L., Nelson, D.L. and Cox, M.M. (2004) "Principles of Biochemistry”. Fourth Edition. W.H.Freeman and Company, New York. (EN ESPAÑOL por Ediciones Omega, 2001).

8 Stryer, L, Berg, J.M. y Tymoczko J.L. "Bioquímica", 5th ed. Reverté, Barcelona, 2002.

9 Alexander Wlodawer and Jiri Vondrasek. INHIBITORS OF HIV-1 PROTEASE:A Major Success of Structure-Assisted Drug Design. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1998. 27:249–84

10 Polgár L (Ed) (1989) Mechanisms of Protease Action. Chap. 3. CRC Press Inc, Boca. Raton, FL. 23. Hedstrom L (2002) Chem Rev 102:4501 Vito Turk Proteases: New Perspectives – 1999 – 231 páginas

11 Tami I. Spector (University of San Francisco):  "The Molecular Aesthetics of Disease: The Relationship of AIDS to the Scientific Imagination" (pp. 51-71)

12 Introducción a la química terapéutica .Cirilo Delgado, Antonio Delgado Cirilo Cristina Minguillón, Llombart, Jesús Joglar
Tamargo. 2003. Ediciones Díaz de Santos. 536 paginas

13 Dietrich MA, Butts JD, Raasch RH. VIH-1 Protease inhibitors: A review. Infect Med 1999; 16(11): 716-38

14 Ocaña I. Inhibidores de la proteasa del VIH-1. El Farmacéutico Hospitales 1998; 89:14-9

15 Pumarola T, Vidal C. Resistencia a los inhibidores de la proteasa. Significado clínico. En: Gatell JM, Mensa J, eds. Nelfinavir: La nueva generación de inhibidores de la proteasa. Barcelona: Editorial Antares; 1999; p. 87-110.

16 Soriano Vicente. Resistencia a loa antirretrovirales 2005.Publicaciones Permanyer.67p.

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