Reacciones de precipitación (II): electroforesis

2. REACCIONES DE PRECIPITACIÓN: Electroforesis.

2.1. ELECTROFORESIS.

2.2. INMUNOELECTROFORESIS (IEF).

2.3. RADIOINMUNOELECTROFORESIS.

2.4. ELECTROINMUNODIFUSIÓN.

2.4.1. ELECTROFORESIS DE CONTRACORRIENTE.

2.4.2. ELECTROINMUNODIFUSIÓN CUANTITATIVA O ELECTROFORESIS ROCKET.

2.4.3. ELECTROFORESIS CRUZADA DE LAUREL.

2.5. INMUNOFIJACIÓN.

2.5.1. CARACTERÍSTICAS

2.5.2. ESQUEMA DE LA TÉCNICA

2.5.3. GAMMAPATÍAS MONOCLONALES

2.5.4. TIPOS DE COMPONENTES MONOCLONALES

2. REACCIONES DE PRECIPITACIÓN: Electroforesis.

2.1. ELECTROFORESIS.

Separación de proteínas del suero en función de su comportamiento en el campo eléctrico.

clip_image002

La velocidad de las particulas depende de:

  • La carga de las mismas
  • La intensidad del campo eléctrico y
  • Del coeficiente de fricción de las moléculas con el medio

TIPOS DE ELECTROFORESIS

clip_image004

EQUIPO DE ELECTROFORESIS

  • Fuente de alimentación

clip_image006

  • Soporte para las tiras de acetato de celulosa

clip_image008

o Aplicador

clip_image010

o Cubeta y puente

clip_image012

o Las tiras de acetato de celulosa

clip_image014

o Reactivos

clip_image016

Se hace correr una alicuota de suero en un gel de agarosa y con tampón barbital (pH 8.4), en el que las Ig (con carga positiva) se desplazan hacia el cátodo. Después de correr el gel, éste es fijado en una solución ácido-alcohol y se tiñe con un colorante de proteínas, y por ultimo se hace un densitometrado. Es una técnica CUALITATIVA.

clip_image018

Sirve para:

– Detectar hipergammaglobulinemias.

– Calcular la fracción gamma.

– Detectar paraproteínas (componentes monoclonales) en el suero..

2.2. INMUNOELECTROFORESIS (IEF).

clip_image020

  • Prueba CUALITATIVA.
  • Método combinado de precipitación.
  • Precipitación por difusión.
  • Electroforesis de los antígenos de acuerdo a su carga.
  • Útil para determinar mezclas complejas de Ag o Ac (Ac´s monoclonales clásicas en mieloma, linfomas).

En esta técnica, hay 5 fases:

1. Se prepara un gel de agarosa sobre un porta y se hace un pocillo para el suero y un canalillo para el anticuerpo específico.

2. Migración de antígenos por carga (Separación). Los Ag del suero se separan primero en base a su carga eléctrica. El pH se elige de modo que unos Ags se carguen positivamente y migren hacia el cátodo, y otros Agsse carguen negativamente y migren hacia el ánodo.

3. Difusión. El canalillo se llena con el Ac específico y se deja reposar para conseguir la difusión.

4. Formación del precipitado. Ag y Ac reaccionan y precipitan, formando arcos de precipitación.

5. Interpretación de las bandas.

clip_image022

2.3. RADIOINMUNOELECTROFORESIS.

– Se marca radiactivamente los Ag y se hace una IEF; después se hace una autorradiografía de las bandas obtenidas (se visualizan mejor).

– Es una prueba CUALITATIVA y/o semicuantitativa.

2.4. ELECTROINMUNODIFUSIÓN.

Consiste en acelerar la formación de la banda de precipitación por la acción de un campo eléctrico. Con estas técnicas se detectan [Ag] de 20 mgr/ml y [Ac] de 20 mgr/ml. Estas técnicas se basan en que el Ag y el Ac tienen cargas diferentes al pH seleccionado; puesto que la mayoría de los Ag tienen un pI bajo y los Ac alto. Si las cargas sobre el Ag y Ag apenas difieren, se puede modificar la molécula químicamente.

clip_image024

2.4.1. ELECTROFORESIS DE CONTRACORRIENTE.

Es una IDD acelerada por el paso de una corriente eléctrica. Es muy importante que la carga neta del Ag sea (-) y Ac sea (+) y que sean colocados en el lugar adecuado en el campo eléctrico (que viajen uno al encuentro del otro). Es una técnica CUALITATIVA.

La sensibilidad es de 10-20 veces mas que en el Mancini.

2.4.2. ELECTROINMUNODIFUSIÓN CUANTITATIVA O ELECTROFORESIS ROCKET.

Es un Mancini acelerado por un campo eléctrico. El pH del gel se elige para que el Ac tenga carga neutra y permanezca inmóvil, y el Ag tenga carga negativa y se desplace hacia el ánodo.

En un extremo del gel se perforan los pocillos donde se pone el Ag a distintas concentraciones. El Ag debe estar cargado negativamente para que se desplace hacia el ánodo. El Ag difunde y se forman bandas de precipitación con forma de cohete (cuanto menor es la concentración del Ag, menor es el tamaño del rocket). Es una técnica CUANTITATIVA en la que se puede construir una curva estándar representando altura frente a concentración de Ag.

2.4.3. ELECTROFORESIS CRUZADA DE LAUREL.

– Primero se hace una electroforesis para que los Ag se separen (como en la IEF).

– Después se corta una tira con el Ag separado y se aplica sobre otro gel que contiene Ac específicos.

– Se hace una electroforesis cruzada como en la IEF.

– Se forman bandas de precipitación.

– Es una técnica CUALITATIVA con la que podemos reconocer Ag.

2.5. INMUNOFIJACIÓN.

2.5.1. CARACTERÍSTICAS

La inmunofijación es una técnica de laboratorio que permite el estudio de proteínas en sangre y orina, específicamente la identificación de componentes monoclonales u oligoclonales .

Las bandas anormales en las corridas electroforéticas de proteínas de sueros u orinas, principalmente aquellas situadas en las fracciones de beta globulinas y de gamma globulinas son siempre sospechosas de ser proteínas monoclonales, y por lo tanto son un indicio de gammapatías monoclonales.

clip_image026

– La electroforesis seguida de inmunofijación es una técnica sencilla que permite que una proteína sea retenida después de la electroforesis, in situ, mediante la formación de un complejo insoluble con su anticuerpo. Es fácil de realizar (provee resultados en 2 o 3 horas) y permite lograr mayor sensibilidad que una inmunoelectroforesis, así como una interpretación mas sencilla.

2.5.2. ESQUEMA DE LA TÉCNICA

La inmunofijación es una electroforesis de proteínas seguida de una inmovilización de las mismas al enfrentarse a un antisuero específico formando un complejo insoluble que luego se revela por coloración.

Se realiza en cuatro etapas:

1-Separación de proteínas mediante electroforesis en gel de agarosa. Se separan las proteínas plasmáticas en un gel de agarosa que tiene 5 calles, como en una electroforesis normal.

2-Inmunofijación (inmunoprecipitación) de las proteínas separadas. Se hace una incubación del gel con antisueros específico (IgM, IgG, IgA, cadenas kappa, cadenas lambda) en cada calle del gel, durante 30 minutos a 30-40 ºC. Los carriles de migración electroforética apropiados son recubiertos con los antisueros individuales, los cuales difunden dentro del gel y precipitan los antígenos correspondientes cuando estan presentes. Las proteínas del carril de referencia son fijadas con una solución fijadora.

3-Prensado y lavado. Las proteínas solubles no precipitadas se eliminan del gel mediante un blotting y un lavado. La precipitación del complejo antígeno-anticuerpo queda fijada en la matriz del gel.

2.5.3. GAMMAPATÍAS MONOCLONALES

El componente monoclonal, llamado también paraproteína o disglobulinemia o gammapatía monoclonal, se refiere a una producción excesiva de un tipo de inmunoglobulina. El aumento en la proliferación de un clon específico de linfocitos B hiperestimulados o malignos genera una población homogénea de inmunoglobulina monoclonal.

Tipos de gammapatías monoclonales:

I.- MALIGNAS:

1. Mieloma Múltiple

2. Variantes de Mieloma:

– Mieloma Quiescente

– Mieloma No Secretor

– Leucemia de Células Plasmáticas

– POEMS

3. Plasmocitomas localizados

– Plasmocitoma Óseo Solitario

– Plasmocitoma Extramedular

4. Macroglobulinemia de Waldenström

5. Amiloidosis Primaria

II.- NO MALIGNAS:

1. Gammapatía Monoclonal de Significado Indeterminado

2. Gammapatías secundarias

2.5.4. TIPOS DE COMPONENTES MONOCLONALES

– Hiperproducción selectiva de inmunoglobulina monoclonal ( G,A,M y en menor frecuencia D y E), componente monoclonal que puede ser benigno o maligno.

– Hiperproducción de cadenas livianas libres monoclonales (aproximadamente el 5% de los casos).Esto es el incremento excesivo en la biosíntesis de cadenas livianas Kappa o Lambda libres. Dicha anormalidad es encontrada exclusivamente en mieloma de cadenas livianas maligno, generalmente asociado a hipogammaglobulinemia (GAM).

– Hiperproducción de cadenas pesadas libres o llamada también enfermedad de cadenas pesadas

Artículos relacionados: