Tráfico de proteínas

1. SORTING DE PROTEÍNAS.

Todas las proteínas se originan en los ribosomas del citosol, pero a partir de este punto el tráfico diverge en dos ramales principales. En cada una de las estaciones intermedias por las que pasa la proteína hasta su destino final, se realiza una decisión de sí la proteína se queda retenida en ese compartimento o sigue hasta su destino final. En la mayoría de las ocasiones se necesita una señal determinada, pero también hay señales por defecto (en ausencia de señal).

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1.1. PÉPTIDO SEÑAL.

Los péptidos señales son secuencias cortas (16-30 aminoácidos) que contienen un aminoácidos cargado seguido por un grupo de 6-12 aminoácidos hidrofóbicos. Estos aminoácidos hidrofóbicos son esenciales para la unión a un receptor presente en la membrana del ER .

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La señal se halla en una secuencia sencilla y discreta de aminoácidos situada en el extremo N-terminal o C-terminal que se halla asequible en la molécula plegada. Este péptido señal es a menudo eliminado de la proteína una vez que es ejecutada la decisión de clasificación. Los péptidos señal son usados para dirigir las proteínas desde el citosol al RE, mitocondria, peroxisomas, cloroplastos, núcleo. También son usados para retener las proteínas en el RE.

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Las señales conservadas entre los distintos organismos:

a) Retículo endoplasmático:

– Localización de la señal en la proteína: N-terminal

– Eliminación de la señal tras entrar en el orgánulo: sí

– Naturaleza de la señal: “Núcleo” de 6 – 12 aminoácidos hidrofóbicos, generalmente precedido de 1 o más aminoácidos básicos

b) Núcleo:

– Localización de la señal en la proteína: interna

– Eliminación de la señal tras entrar en el orgánulo: no

– Naturaleza de la señal: 1 grupo de 5 aminoácidos básicos, o dos grupos más pequeños de aminoácidos básicos, separados por aproximadamente 10 residuos

c) Peroxisoma:

– Localización de la señal en la proteína: C-terminal

– Eliminación de la señal tras entrar en el orgánulo: no

– Naturaleza de la señal: generalmente Ser-Lys-Leu en el extremo C-terminal)

d) Mitocondria:

– Localización de la señal en la proteína: N-terminal

– Eliminación de la señal tras entrar en el orgánulo: sí

– Naturaleza de la señal: 3 – 5 residuos de Arg o Lys no consecutivos, generalmente en combinación con Ser y Thr; sin residuos ácidos (Asp, Glu)

1.2. EL TRÁFICO DE PROTEÍNAS TIENE DOS RAMALES DIFERENTES.

TRÁFICO CITOSÓLICO:

· Las proteínas sintetizadas se liberan al citosol.

· Algunas de estas proteínas llevan señales para ser exportadas hasta mitocondrias, cloroplastos, núcleo, o peroxisomas.

· La mayoría no tienen señales específicas y se quedan en el citosol.

TRÁFICO TRAVÉS VESÍCULAS DE TRANSPORTE (principal):

· Son proteínas destinadas a ser secretadas desde la célula, además de aquellas proteínas destinadas a residir en el RE, A. de Golgi, membrana plasmática, lisosomas.

· Todas estas proteínas van siendo transferidas al RE mientras son sintetizadas, por medio de una señal en el extremo N-terminal (peptido señal). Los ribosomas se unen al RE y las proteínas son insertadas en la membrana del RE. Cuando se termina la síntesis, algunas proteínas pueden ser liberadas de la membrana y otras quedan insertadas en la membrana.

· El transporte por la celula se lleva a cabo por medio de vesículas que se desprenden como brotes de un compartimento dador y viajan por el citosol hasta alcanzar el compartimento receptor; entonces se fusionan a este último.

· Cuando se produce la fusión al compartimento receptor, el contenido de la vesícula se vuelca al lumen del mismo. La membrana vesicular, por su parte, se incorpora a la membrana receptora. Si la estructura diana es la membrana plasmática, entonces el contenido es vertido al medio.

· En su trayecto de una cisterna a otra, las vesículas son movidas por elementos del citoesqueleto.

· Las vesículas que participan en el transporte, cualquiera sea el compartimento de origen, son vesículas revestidas con una cubierta formada por subunidades proteicas ensambladas a modo de enrejado sobre la cara externa de la membrana vesicular. Dicho revestimiento es adquirido en el momento en que se produce la gemación o protrusión de la vesícula y es su misma causa: a medida que las subunidades se ensamblan generan la curvatura de la membrana que da origen al brote. El revestimiento se desensambla inmediatamente después de la brotación.

· Las membranas de las cisternas poseen pares de moléculas complementarias: v-SNARE (en la vesícula de transporte) y t-SNARE (en la cisterna destino o target). La fusión de una vesícula con una cisterna sólo se produce previo reconocimiento del par v-SNARE /t-SNARE adecuado.

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1.3.

2. MODIFICACIONES POST-TRADUCIONALES.

Se han descrito más de 100 modificaciones post-transcripcionales diferentes de las cadenas de aminoácidos de las proteínas. Muchas de estas modificaciones están fuertemente controladas por enzimas específicos, como la glicosilación de proteínas en el RE y Aparato de Golgi.

2.1. TIPOS DE MODIFICACIONES POST-TRADUCIONALES:

A) Formación de enlaces covalentes

· Puentes disulfuro entre Cys

· Unión de pequeñas moléculas: fosforilación (grupos fosfato), O- y N-glicosilación (monosacáridos), hidroxilación (grupos hidroxilo), acilación (grupos acilo), metilación (grupos metilo), amidación (grupos amida), ADP-ribosilación (por ejemplo en la proteína eEF-2 en la síntesis de proteínas)

· Unión de otras proteínas: ubiquitinación, SUMOilación

B) Rotura de enlaces covalentes

· Proteolisis: escisión de un fragmento proteico y activación de la proteína.

· Autoproteolisis.

· Rotura de secuencias señal: peptidasas de la señal.

· Proteolisis intramolecular: neuropéptidos, hormonas (insulina), morfógenos (notch, shh), activación de zimógenos, cascada de coagulación sanguínea.

C) Según el aminoácido modificado

· Extremo N-t: formilación, acetilación, acilación, mistirilación, glicosilación

· Extremo C-t: metilación, ADP-ribosilación

· Arg: acetilación, metilación, ADP-ribosilación

· Asn: N-glicosilación, metilación, desamidación

· Asp: metilación, hidroxilación

· Cys: formación de puentes disulfuro, de SelenoCys

· acilación, prenilación, unión de grupos prostéticos (hemo)

· Glu: metilación, carboxilación, ADP-ribosilación

· Gln: desamidación

· His: metilación, fosforilación, ADP-ribosilación

· Lys: N-acetilación, metilación, oxidación, hidroxilación, ubiquitinación

· Met: formación de sulfóxidos

· Phe: Beta-hidroxilación, O-glucosilación

· Pro: hidroxilación, O-glicosilación

· Ser: fosforilación, O-glicosilación, acetilación

· Thr: fosforilación, O-glicosilación, metilación

· Trp: Beta-hidroxilación

· Tyr: fosforilación, yodación, adenilación, sulfatación, hidroxilación

2.2. LOCALIZACIÓN DE LAS MODIFICACIONES POS-TRADUCCIONALES

· Núcleo: acetilación, fosforilación (no exclusivas)

· Lisosoma: resto manosa-6P en proteínas lisosomales

· Mitocondria: N-formilación

· Aparato de Golgi: N- y O-glicosilación, sulfatación, palmitiolación

· Retículo endoplasmático (ER): N-glicosilación, unión a fosfatidil-inositol

· Citosol: acetilación, metilación, fosforilación

· Ribosoma: mistirilación

· Membrana plasmática: N- y O-glicosilación, unión a fosfatidil-inositol

· Fluido extracelular: N- y O-glicosilación, acetilación, fosforilación

· Matriz extracelular: N- y O-glicosilación, fosforilacion, hidroxilacion, sulfatación

2.3. FUNCIÓN DE LAS MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES

· Protein targetting: Tráfico intra ó intercelular. Por ejemplo, manosa-6P, ubiquitinación

· Estabilidad de la proteína: Sialo vs. asialoglicoproteínas, ubiquitinación

· Determinante clave para la actividad proteica: Bolsillo de unión de receptores de membrana

· Control de la actividad: Fosforilación / defosforilación

· Proteolisis: activación de caspasas, de factores de coagulación

· Regulación de la expresión génica: acetilación de histonas

3. DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS CITOSÓLICAS.

3.1. PROTEÍNAS PROGRAMADAS PARA SER DESTRUIDAS RÁPIDAMENTE.

Las proteínas llevan señales que determinan su vida media. La mayoría de las proteínas del citosol tienen una vida media larga (varios días), pero otras proteínas son degradadas a los pocos minutos de ser sintetizadas. Estas proteínas de vida corta suelen ser:

– Enzimas que catalizan pasos limitantes en una vía metabólica (expresión controlada por las condiciones ambientales).

– Producto de oncogenes celulares como el “fos” y el “myc”, que controlan el crecimiento y la división celular.

En estas proteínas de rápido recambio, la concentración en el citosol puede estar controlada por la transcripción. En ocasiones, los RNAm de estas proteínas también están sometidos a una alta velocidad de recambio.

3.2. VÍA PROTEOLÍTICA DEPENDIENTE DE UBIQUITINA.

Es una de las vías que se usan para la destrucción de las proteínas de rápido recambio. Cuando los aminoácidos Met, Ser, Thr, Ala, Cys, Gly y Pro están en el extremo N-t, estabilizan la cadena; los otros 12 aminoácidos inducen un ataque proteolítico. Estos aminoácidos desestabilizantes no se encuentran nunca en el extremo N-t de las proteínas citosólicas estables, pero sí en proteínas que son transportadas a otros compartimentos (RE, A. de Golgi); de esta forma se asegura la destrucción de las proteínas extraviadas.

Es la vía principal del catabolismo de proteínas, importante para el mantenimiento celular y recambio de muchas proteínas reguladoras. Las chaperonas cooperan aquí para mediar degradación de proteínas anormales.

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En esta vía, muchas copias de la proteína ubiquitina son incorporada a la proteína diana que se va a degradar. Esta reacción está catalizada por un complejo multienzimático que se une al extremo N-t. Primero une una molécula de ubiquitina a un resto de Lys, y luego añade otras moléculas de ubiquitina, produciendo una cadena de multi-ubiquitina ramificada. A continuación, una proteasa dependiente de ATP degrada rápidamente estas proteínas marcadas. Sólo las proteínas con una cadena de multiubiquitina son degradadas.

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La ubiquitinización selectiva se realiza por una serie de enzimas que constituye el sistema Ub ligasas

§ La Ubiquitina marca las proteínas para degradación en el proteasoma

§ El proceso de ubiquitinización es específico y regulado

§ El complejo proteasoma 26S está presente abundantemente en todas las células

§ La vía ubiquitina-proteasoma controla la homeostasis de las proteínas en la célula

Para el MARCAJE DE PROTEÍNAS CON Ub se necesitan 3 enzimas para que la proteína se ligue a Ub

§ E1: enzima que activa Ub con gasto de energía (Gly terminal C de Ub reacciona con Lys cadena lateral del sustrato)

§ E2: enzima que conjuga y cataliza la unión de Ub al sustrato

§ E3: enzima ligasa que junto con E2 reconoce al sustrato

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Posteriormente se produce la degradación en el proteosoma. El Sustratos marcados son reconocidos, desdoblados y degradados por el proteasoma.

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Funciones de la Ub:

• Además de marcaje para degradación

• Regula ciclo celular

• Repara ADN

• Participa en embriogénesis

• Regula transcripción

• Apoptosis

El proteosoma es un gran complejo con múltiples subunidades que degrada proteínas celulares cuando no se necesitan más

1. subcomplejo catalítico

2. subcomplejos reguladores

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4. CHAPERONAS.

Se disparan con aumento de temperatura: proteínas heat shock (HSP) y otros estrés celular como ROS. Son proteínas que ayudan a la célula a sobrevivir a agresiones severas. Se cree que estas proteínas ayudan a solubilizar y a volver a plegar proteínas desnaturalizadas o mal plegadas. Estudios de secuenciación de DNA, sugieren que hay tres familias de proteínas: proteínas de 25 Kd, proteínas de 70 Kd y proteínas de 90 Kd.

Las chaperoninas son HSP que trabajan en el plegamiento de péptidos complejos y recuperan las proteínas del daño por estrés.

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Las chaperonas son varias familias de proteínas altamente conservadas que median el plegamiento correcto de otras proteínas. Se dirigen a proteínas mal plegadas y evitan su agregación.

Se asocian al polipéptido naciente en el ribosoma, promueven el plegamiento correcto y evitan las interacciones peligrosas con otras proteínas.

Se enlazan para estabilizar a proteínas plegadas o parcialmente plegadas y evitan interacciones inapropiadadas con proteínas vecinas.

Pueden enviar a las proteínas a degradación en el sistema Ub-proteasoma.

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Funciones de las chaperonas:

1. Retira clatrina

2. Inhibe apoptosis

3. Disminuye ROS

4. Plegamiento normal de proteína naciente

5. Media degradación autofágica

6. Repliegan proteínas

7. Evitan agregación de proteínas anormales

8. Envían proteínas anormales a degradación

9. Promueve degradación asociada a RE

10. Participa en fusión de vesículas con membrana

11. Promueve enlace horm. esteroideas al receptor nuclear

12. Regula su expresión

5. CONTROL DE LA ESTABILIDAD DE LAS PROTEÍNAS: MODIFICACIÓN DEL EXTREMO AMINOTERMINAL.

Al parecer, las proteínas que están programadas genéticamente para ser rápidamente degradadas, adquieren el aminoácido desestabilizante inmediatamente después de su síntesis. Las proteínas son sintetizadas con una Met en el extremo N-t (estabilizante), pero a menudo es eliminada por una aminopeptidasa específica poco después de su síntesis. Además, una aminoacil-tRNA-proteína transferasa añade una aminoácido desestabilizante al extremo N-t de determinadas proteínas.

En la degradación de una proteína mal plegada, lo que se reconoce es un grupo de aminoácidos hidrofóbicos que antes estaba enterrado en el núcleo de la proteína. Esto conduciría a modificaciones del extremo N-t y a la posterior adición de ubiquitina.

La acetilación del extremo N-t de las proteínas aumenta la estabilidad porque tienen el extremo N-t bloqueado. Son proteínas acetiladas, las del citoesqueleto y las histonas (proteínas de vida media larga).

C. TRANSPORTE DE PROTEÍNAS Y MOLÉCULAS DE RNA HACIA DENTRO Y FUERA DEL NÚCLEO.

1. COMPONENTES DE LA ENVOLTURA NUCLEAR.

– Membrana nuclear interna: contiene proteínas específicas que se unen a la lámina nuclear que la soporta, y entra en contacto con los cromosomas y los RNA nucleares.

– Espacio perinuclear: espacio que hay entre las dos membranas.

– Membrana nuclear externa: se parece a la membrana del RER.

– Poros nucleares: es una estructura en forma de disco conocida como complejo poro que tiene estructura ortogonal.

El poro deja un canal acuoso en el centro del poro (9nm) a través del cual viajan moléculas solubles en agua de Pm< 60Kd. En ocasiones hay partículas ribonucleícas en el centro del poro, que pueden ser ribosomas u otras partículas atrapadas.

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2. TRANSPORTE ACTIVO DE PROTEÍNAS HACIA EL INTERIOR DEL NÚCLEO A TRAVÉS DE LOS POROS NUCLEARES.

Muchas proteínas nucleares interactúan con Rc proteicos del poro, que transportan activamente (hay gasto de ATP) proteínas al interior del núcleo, ensanchando el canal. Aparentemente, el poro funciona igual que un diafragma de apertura controlada que cuando es activado por una señal de una proteína de grandes dimensiones, se abre únicamente lo necesario.

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La selectividad del transporte nuclear reside en SEÑALES DE IMPORTACIÓN NUCLEAR (NLS (nuclear localization signal)), las cuales sólo se presentan en proteínas nucleares. La señal es un peptido corto, rico en aminoácidos cargados positivamente (Lys y Arg). NLS es una secuencia de localización interna que permite el paso de proteínas grandes y acelera el de las pequeñas. No se elimina tras pasar la proteína al núcleo.

GTPasa Ran proporciona energía para transporte a través del poro. La fracción unida a GTP predomina en el interior, la unida al GDP en exterior. Ello se debe a la distribución de Ran-GAP (GTPase-activating protein) y Ran-GEF (guanine exchange factor).

Mecanismo de transporte:

1. La secuencia NLS es reconocida por receptores de exporte y de importe

– Receptores de importe: alfa- y beta-importinas

– Receptores de exporte: exportinas

2. Unión a las nucleoporinas del poro y paso a través del poro nuclear

– Transporte dependiente de GTP

– Ran = GTPasa que dirige el transporte nuclear

3. Separación de las importinas

– NES: nuclear export signal

– Paso del núcleo al citosol (RNAs, proteínas). Mediado por exportinas

3. TRANSPORTE DE MOLÉCULAS DE RNA HACIA EL EXTERIOR DEL NÚCLEO.

Hay un transporte selectivo de moléculas de RNA del núcleo al citosol mediante un sistema de transporte activo parecido al anterior. Las SEÑALES DE EXPORTACIÓN se encuentran en las proteínas asociadas al RNA (partícula ribonucleíca) como las subunidades ribosómicas.

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Exportación de ARNm del núcleo: la unión de proteínas responsables de la exportación tiene lugar durante la transcripción y splicing del ARNm.

Para la exportación del ARNm, éste debe haber finalizado su maduración (eliminación de intrones).

Una vez en el citoplasma, las proteínas responsables de la exportación se liberan del ARNm.

Núcleo exporta: ARNm, ARNt, ARNr (tras ensamblaje con proteínas dentro del núcleo).

D. TRANSPORTE DE PROTEÍNAS AL INTERIOR DE MITOCONDRIAS.

La gran mayoría de las proteínas de las mitocondrías están codificadas por genes nucleares y se sintetizan en los ribosomas citosólicos. Las proteínas codificadas por el genoma de estos orgánulos son pocas y están localizadas principalmente en la membrana mitocondrial interna. Estas proteínas forman subunidades de complejos proteicos cuyas otras subunidades están codificadas por el genoma celular.

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1. TRANSLOCACIÓN HACIA LA MATRIZ MITOCONDRIAL.

Las proteínas que deben ser importadas a la matriz mitocondrial tienen un peptido señal en el extremo N-t, compuesto por 12 aminoácidos. Éste peptido es eliminado cuando llega a la matriz por una peptidasa de señal. El peptido señal es anfipático y forma una alfa-hélice, con los aminoácidos cargados positivamente localizados a un lado, y los hidrofóbicos al otro.

La importación proteica sólo ocurre en zonas de contacto entre las membranas externa e interna. La HSC 70 citosólica y el factor estimulador de la importación mitocondrial (MSF) son chaperonas que mantienen parcialmente desplegadas las proteínas, lo que permite su translocación. Las proteínas desplegadas se unen a receptores en la membrana mitocondrial externa, son translocadas hacia la organela a través de un canal limitado por proteínas. Este proceso depende del gradiente electroquímico de la membrana interna y de la hidrólisis de ATP.

El proceso de translocación hacia la matriz mitocondrial depende de un gradiente electroquímico a través de la membrana interna (impulsa la unión del peptido señal a la membrana) y de la hidrólisis de ATP (usado para desplegar la proteína). El gradiente se forma a mediada que los protones son bombeados hacia el espacio intermembrana, durante el transporte electrónico en la membrana mitocondrial interna. El plegamiento definitivo suele deberse a una chaperonina (HSC 60) que hidroliza ATP.

2. MECANISMO DE TRANSLOCACIÓN.

El proceso de importe mitocondrial empieza cuando las proteínas precursoras son desplegadas por Chaperonas (proteínas que manipulan el plegamiento de las proteínas) citosólicas que las guían a la puerta central de entrada mitocondrial, una translocasa situada en la membrana exterior, el complejo TOM (acrónimo Translocase of the Outer Mitocondrial Membrane en inglés). Una vez en la translocasa, las proteínas precursoras dependiendo de su localización final en los distintos compartimentos de la mitocondria siguen diferentes vías de importación mitocondrial.

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La estructura y no la secuencia es reconocida por receptores específicos: las secuencias lineales son muy diferentes (no las secuencias consenso definidas). La cavidad hidrofóbica del receptor de la membrana externa Tom20 interacciona con los residuos hidrofóbicos.

Las proteínas que portan señales presecuencia (una secuencia de 25-30 aminoácidos situada en extremo amino terminal de esas proteínas constituida por aminoácidos cargados mayoritariamente de forma positiva, como la mayoría de las proteínas de la matriz mitocondrial), son importadas por una translocasa presecuencia situada en la membrana interior, el complejo TIM23 (acrónimo de Translocase of the Inner Mitocondrial Membrane en inglés), de una manera que depende del potencial eléctrico que existe a través de la membrana interna. Una proteína motora potenciada por ATP asociado (PAM) a esa translocasa es requerido para completar la translocación a la matriz mitocondrial, donde una peptidasa procesadora de la matriz escinde finalmente la presecuencia. Las proteínas integradas en la membrana interna (e.g. las proteínas transportadoras, intercambiadores antiportes de ATP/ADP, Piruvato/OH- (iones hidroxilo, Pi/OH-, etc…) son guiadas por complejos de pequeñas proteínas Tim a través del espacio intermembrana e insertadas en la membrana por una translocasa transportadora dependiente del potencial eléctrico de membrana, el complejo TIM22. Así, el transporte de proteínas precursoras a través de la membrana exterior y el espacio intermembrana requiere dos fuerzas directoras de la membrana interna: esto es el potencial de membrana y la fuerza proporcionada por la hidrólisis de ATP en ADP+ Pi del complejo PAM.

Por otra parte precursores de las porinas (proteínas de tipo beta-barril) de la membrana exterior son transferidas desde complejo TOM para se clasificadas, distribuidas y ensambladas por una maquinaria de ensamblaje (complejo SAM, Sorting and Assembly Machinary en inglés) con la ayuda de pequeñas proteínas llamadas Tim del espacio intermembrana.

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