8. AISLAMIENTO Y PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS.
8.1. OBTENCIÓN DE ANTISUEROS (ANTICUERPOS POLICLONALES).
8.3. REDUCCIÓN DE SU INMUNOGENICIDAD. SÍNTESIS DE ANTICUERPOS QUIMÉRICOS
8.3.1. Disminución de la Inmunogenicidad de los anticuerpos
8.3.2. Variantes biotecnológicas
8. AISLAMIENTO Y PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS.
- Obtención de antisueros (anticuerpos policlonales). Cuando un animal de experimentación es estimulado con un inmunógeno, éste responde produciendo gran variedad de Ac contra distintos componentes del Ag (polipéptidos, polisacáridos), y epitopos de cada uno de ellos. El conjunto de estos Ac es el antisuero (mezcla heterogénea de Ac) formado por Ac monoclonales. Dicha mezcla es heterogénea e irreproducible.
- Síntesis de anticuerpos monoclonales. Para obtener una solución que contenga un sólo Ac, y siempre el mismo, es necesario lograr la proliferación de un sólo LB. Algunos investigadores intentaron obtener Ac homogéneos (monoclonales) mediante transformación (inmortalización) de LB con el virus de Epstein Barr (VEB), estableciendo algunas líneas productoras, pero en poca cantidad.
8.1. OBTENCIÓN DE ANTISUEROS (ANTICUERPOS POLICLONALES).
Para la obtención de inmunosueros es necesario inocular varios animales con el mismo inmunógeno para seleccionar el mejor. El Ag se administra junto un adyuvante al menos en la inmunización primaria.
El antisuero se obtiene mediante el sangrado de los animales y después se comprueba el nivel de Ac mediante ELISA o Western-blot.
El antisuero se puede purificar por fraccionamiento proteico:
– Precipitación de gamma-globulinas con sulfato amónico al 30-50%.
– Filtración en gel para obtener moléculas de tamaño correcto.
– Cromatografía de intercambio iónico a pH 7: aísla las moléculas con carga positiva (Ac).
– Cromatografía de afinidad sobre ligandos naturales, como la proteína A estafilococica, que se une a Fc de los Ac.
– Cromatografía de afinidad mediante Ag fijado al soporte de la columna. Eluir y obtenemos los Ac puros.
8.2. PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS. TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN DE CÉLULAS SOMÁTICAS o HIBRIDOMAS (Kohler y Milstein).
La manera de hacerlo consiste en fusionar una célula plasmática específica para el Ag deseado, con otra célula que posee una capacidad indefinida de división. Por tanto, la célula fusionada será capaz de vivir en cultivo, dividirse y producir Ac.
Las células parentales responsables de la proliferación del hibridoma, son de una línea de mieloma. Son células capaces de vivir y dividirse in vitro, seleccionadas por carecer de la enzima HG PRT (hipoxantil-guanil-fosforribosil-transferasa); este defecto enzimático resulta necesario para la selección post-fusional de híbridos. La HG PRT es una enzima que utiliza guanina ó hipoxantina para producir purinas, lo que permite la reutilización de las bases cuando la síntesis de novo se ve interrumpida, por ejemplo por la aminopterina que bloquea la síntesis de purinas y timidinas. La adición de timidina al medio permite a la célula sintetizar timidina monofosfato, vía timidina quinasa, pero al no poder utilizar bases púricas, la célula muere, aun en presencia del precursor de hipoxantina.
El medio selectivo HAT contiene:
– Hipoxantina y timidina para enriquecer el cultivo.
– Aminopterina como inhibidor de la síntesis de novo.
En presencia de aminopterina sólo podrán sobrevivir aquellas células que expresan HG PRT, como los hibridomas; las células de mieloma morirán (son HG PRT -) y las células plasmáticas de bazo no se desarrollan en cultivo (no son inmortales). Otra característica de las células de mieloma es la de ser células no secretoras de Ac.
La obtención de Ac monoclonales sigue el siguiente esquema:
1) Inmunización de ratones con Ag soluble disuelto en adyuvante incompleto de Freund por vía intraperitoneal o intramuscular, administrando finalmente una dosis de recuerdo de Ag no emulsionado por vía intravenosa, 3 días antes de la fusión.
2) Fusión: se realiza 3 días después de la dosis de recuerdo del Ag, momento de máxima presencia de blastos en el bazo. Como agente fusionante se usa el polietilenglicol (PEG).
3) Selección de los híbridos linfocito-mieloma en medio HAT.
4) Cultivo de hibridomas en un medio que favorezca la división celular y la producción y secreción de Ac (RPMI 1640). El cultivo se realiza en placa de 96 pocillos a 37ºC, en estufa con un 5% de CO2.
5) Monitorización de la producción de Ac: la detección de Ac específicos en el medio de cultivo donde crecen los hibridomas es el punto más importante. Las técnicas deben ser de alta sensibilidad, capaces de detectar mgr/ml y rápidas para descartar cultivos inútiles. El método más utilizado es el ELISA.
6) Clonado: los cultivos que dan reacción positiva específica deben ser clonados lo más rápidamente posible para lograr el establecimiento de clones productores de Ac. El método más utilizado es la dilución en medio líquido o método de la dilución límite. Consiste en realizar diluciones de la población original para obtener cultivos que contengan una sola célula capaz de originar el clon correspondiente.
7) Producción de Ac monoclonales en grandes cantidades. Se puede realizar:
· «In vivo»: se inocula intraperitonealmente en ratones histocompatibles con la línea celular y se obtiene el líquido ascítico del animal en el que se pueden obtener concentraciones de Ac de mgr/ml.
· «In vitro»: realizar cultivos celulares de los híbridos a gran escala, obteniéndose concentraciones de mgr/ml en los sobrenadantes.
8.3. REDUCCIÓN DE SU INMUNOGENICIDAD. SÍNTESIS DE ANTICUERPOS QUIMÉRICOS
8.3.1. Disminución de la Inmunogenicidad de los anticuerpos
- Anticuerpos xenogénicos
– Estimulan la formación de antianticuerpos.
- Anticuerpos quiméricos (70% h +30% murino)
– Regiones variables murinas.
– Regiones constantes humanas funciones efectoras.
- Anticuerpos humanizados (90%h+10% murino)
– Reemplazo de regiones armazón originales del domino variable por otras humanas para disminuir todavía más la inmunogenicidad.
8.3.2. Variantes biotecnológicas
A) Quimeras con región Fc. alargan vida media de la molécula asociada
• Anticuerpos biespecíficos.
• Inmunopartículas biespecíficas
• Inmunoliposomas liposomas recubiertos de anticuerpos monoclonales letales como transportadores de sustancias toxicas intracelulares ej. RNAasas
B) El “toque humano” ha permitido el uso clínico
• Anticuerpos quiméricos (1995-) V murina C humana
– Simulect rechazo
– Remicade Infliximab Crohn, AR
• Humanizados HVR murina FR humana C humana
– Zenapax (1997) (CD25)
– Herceptin (1998) cáncer de mama metastático que expresa EGF receptor
– Campath (2001) antiCD52
– Xolair Omalizumab(2003) anti IgE asma alérgica
– Efalizumab (2004) psoriasis
– 200 tipos más están actualmente utilizándose en ensayos clínicos en humanos.