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Carga viral del VIH: Características generales

CUANTIFICACIÓN DE LA CARGA VÍRICA EN LA ASISTENCIA DE LOS PACIENTES CON INFECCIÓN POR VIH

1. INTRODUCCIÓN.

El conocimiento de la patogenia de la infección por el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) ha progresado de forma importante en los últimos años y ello ha ido en paralelo con la introducción de nuevos fármacos antirretrovíricos de eficacia notable (Terapia Antirretroviral de Gran Actividad: TARGA). Uno de los avances más importantes ha sido el desarrollo de técnicas de detección de la carga vírica plasmática (CVP), término que expresa el número de partículas víricas circulantes en plasma y que cuantifica el número de copias de RNA vírico por mililitro de plasma. En la infección por VIH la cuantificación tiene un extraordinario valor informativo en tres aspectos:

a) Como factor pronóstico en los pacientes con infección VIH, ya que la CVP constituye un parámetro independiente de evolución a SIDA.

b) Como variable intermedia o substitutiva, utilizada en los ensayos clínicos con fármacos antirretrovirales.

c) Como instrumento de decisión de las estrategias de tratamiento antirretrovírico individualizado, tanto para el inicio de éste como para la monitorización de la respuesta terapéutica, evaluando la indicación de cambios de medicación.

En base a esta información, la determinación de la CVP tiene una serie de INDICACIONES:

Figura 1: Curso clínico de los marcadores CD4 y CVP durante la infección por VIH.

2. MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN DE CARGA VÍRICA.

2.1. CARACTERÍSTICAS TÉCNICAS.

Actualmente existen diversas técnicas disponibles que permiten la detección de la carga vírica plasmática. Las diferencias fundamentales radican en los formatos, tiempos y capacidad de procesamiento. Todas las técnicas detectan y cuantifican el subtipo mayoritario B y algunos otros subtipos circulantes (A, C, D, F, G), y solamente la técnica de RT-PCR de Abbott cuantifica el grupo O. Ninguna de las técnicas detecta el VIH-2.

Hay diversos métodos para poder medir en plasma la carga vírica del VIH-1 y cada uno de ellos tiene un diseño diferente:

a) RT-PCR (AMPLICOR HIV-1 MONITOR, Roche Diagnostics).

– La amplificación del RNA del VIH-1 se hace mediante una retrotranscripción seguida de una PCR (RT-PCR).

– Amplicor utiliza un sistema de detección en microplaca de tipo inmunoenzimático con sondas marcadas con peroxidasa más TMB como sustrato y lectura colorimétrica.

b) RT-PCR en tiempo-real (COBAS TAQMAN, Roche Diagnostics; ABBOTT REAL TIME, Abbott).

 

– La detección del producto de amplificación se realiza mediante sondas fluorescentes, siendo técnicas más rápidas y que permiten detectar rangos más amplios (40-107 copias/mL).

– Recientemente se ha introducido la extracción automática de ácidos nucleicos, que supone un considerable avance en la estandarización de la fase de extracción, una de las fases con mayores factores de variabilidad.

c) Amplificación isotérmica de RNA o NASBA (NucliSENS EasyQ® HIV-1 v. 1.2, Biomerieux).

 

– Hay una amplificación isotérmica a 41 ºC en la que participan las enzimas AMV-RT, T7 RNA polimerasa y RNAsa H (NASBA-3SR).

– NASBA emplea un sistema de detección con sondas marcadas tipo Molecular beacon.

d) Amplificación de señal por hibridación molecular o bDNA (VERSANT HIV-1 RNA 3.0 Assay, Bayer).

– Este método no lleva a cabo amplificación del RNA sino que amplifica la señal obtenida mediante sondas de oligonucleótidos (b-DNA).

– Utiliza un sistema de detección con sondas marcadas con fosfatasa alcalina más un sustrato quimioluminiscente.

Tabla 1: Características principales de las técnicas disponibles para la detección de la CVP.

PARÁMETROS

AMPLICOR HIV-1 MONITOR

COBAS TAQMAN HIV-1

ABBOTT REAL TIME

NUCLISENS EasyQ HIV-1

VERSANT HIV-1 RNA 3.0

Método aplicado

RT-PCR

RT-PCR a tiempo real

RT-PCR a tiempo real

NASBA

bDNA

Rango dinámico del método

400-750.000 copias/ml

48-107 copias/ml

40-107 copias/ml

25-3.000.000 UI/mL

75-500.000 copias/ml

Detección de los subtipos de VIH-1 del grupo M

B

A-G

A-H

A-G

A-G

Detección del VIH-2

No

No

No

No

No

Detección VIH-1 grupo O

No

No

Si*

No

No

Método de detección

Colorimetría (peroxidasa)

Fluorescencia

(Sondas de hibridación)

Fluorescencia

(Sondas de hibridación)

Fluorescencia (molecular beacons)

Quimioluminiscencia

(fosfatasa)

Extracción Automática

Si

Si

Si

Si

No

*También detecta el grupo N.

Existen diferencias en la determinación de la carga vírica según el método utilizado, así como variaciones importantes con la misma técnica. La variabilidad intraensayo se ha estimado inferior a 0.2 log y la variabilidad biológica de muestras consecutivas separadas por pocas semanas en un paciente clínicamente estable, se ha calculado en aproximadamente 0.3 log. Por tanto, los cambios superiores a 0.5 log son considerados como relevantes en relación a la replicación vírica. Es recomendable, desde el punto de vista metodológico, que un determinado paciente sea analizado siempre por la misma técnica y sería aconsejable, aunque no imprescindible, que fuera realizada en el mismo laboratorio.

2.2. CONDICIONES DE CONSERVACIÓN Y TRANSPORTE.

Todos los métodos utilizan plasma humano como muestra y se considera que las condiciones de obtención son críticas para conseguir resultados óptimos y fiables. La muestra obtenida en pacientes adultos deberá ser recogida en tubos con aspiración por vacío de 10 ml de sangre anticoagulada con EDTA (los tres métodos aceptan éste procedimiento, aunque AMPLICOR puede funcionar con citrato y NASBA con citrato y heparina). Es crítico el tiempo que transcurra entre la obtención de la sangre completa y la separación del plasma, que debe ser entre 4 y 6 horas, como máximo. Cuando la muestra de sangre completa es enviada a un laboratorio externo, no ubicado en el mismo hospital donde se realiza la extracción, el transporte de la muestra debe realizarse a temperatura ambiente y en contenedor de bioseguridad, no superando dicho periodo de tiempo (2-6 horas); en caso contrario la muestra debe enviarse como plasma. El laboratorio receptor debería rechazar toda muestra que no llegue en las condiciones establecidas.

La obtención del plasma, así como su manejo, almacenamiento y transporte se realizará siguiendo rigurosamente las instrucciones de los manuales de cada método.

Tabla 2: Estabilidad del VIH para la determinación de la carga vírica plasmática

PARÁMETROS

TIEMPO MÁXIMO

Sangre completa

6 horas

Plasma a Tª ambiente (18-20ºC)

24 horas

Plasma a 4-8ºC (frigorífico)

7 días

Plasma a -20ºC (congelador)

Variable

(no recomendado para largo plazo)

Plasma a – 80ºC (criocongelador)

Meses

Congelar/descong. plasma almacenado

2 veces como máximo

2.3. CONDICIONES DE REALIZACIÓN.

Los tres métodos requieren condiciones específicas de seguridad para garantizar, tanto el correcto manejo de la muestra (evitar contaminaciones con RNAsas) como la seguridad del personal técnico (se maneja material infeccioso). En el caso de VERSANT® se realiza una centrifugación a una alta velocidad, por tanto deberá extremarse los cuidados en el manejo del rotor y en el correcto equilibrado de los tubos para garantizar la ausencia de aerosoles accidentales. En cualquier caso, debe disponerse de áreas correctamente definidas para realizar los diferentes pasos de la técnica según las instrucciones que figuran en los manuales. Estas áreas no han de corresponder necesariamente a laboratorios independientes, aunque la localización de la cabina de bioseguridad clase II sí sería recomendable que se situara en habitación independiente. Para cualquiera de los métodos es necesario disponer de una cabina de bioseguridad clase II.

El laboratorio encargado de realizar los estudios de cuantificación de RNA plasmático, por cualquiera de los procedimientos disponibles, necesita unas condiciones mínimas de bioseguridad que garanticen las buenas prácticas de laboratorio y cumpla con los requerimientos de equipos según el método (termociclador, centrífuga de alta velocidad, cabina de bioseguridad clase II, congeladores de -80ºC) e instalaciones (áreas de trabajo adecuado). Asimismo, consideramos que el entrenamiento del personal técnico debe ser riguroso (son métodos con condiciones muy críticas en alguno de los casos) y adecuado al ámbito de aplicación (patología infecciosa). El personal técnico debería estar en dedicación exclusiva durante el tiempo de realización de cualquiera de estos métodos, lo que permitirá a cada laboratorio realizar su programación en función de la demanda.

El tiempo de realización de la técnica elegida, así como el número de muestras que es posible analizar en una jornada normal de trabajo y por un técnico, son detalles importantes que, en función de la demanda, van a influir en el rendimiento de cada laboratorio.

La supervisión por un facultativo con experiencia en técnicas de microbiología parece una condición obvia, dada la repercusión que los resultados obtenidos van a tener en la evolución de los pacientes y en las decisiones que el clínico va a adoptar en función de la carga vírica.

En diferentes países, estas circunstancias han hecho necesario desarrollar programas de control de calidad con el objeto de garantizar la fiabilidad de los resultados obtenidos por estos métodos. En España esta red de control de calidad está coordinada por la Secretaría del Plan del SIDA y el Centro Nacional de Microbiología del Instituto de Salud Carlos III.

3. FRECUENCIA DE REALIZACIÓN DE LA CARGA VÍRICA.

3.1. OBTENCIÓN DE MUESTRA BASAL EN PACIENTES SIN TRATAMIENTO ANTIRRETROVÍRICO PREVIO.

Es recomendable realizar dos determinaciones basales separadas por 2 a 4 semanas, en ausencia de procesos infecciosos, vacunaciones o patología intercurrente. Dado que las técnicas son complejas y la posible sobrecarga de los laboratorios con esta determinación, podría plantearse la alternativa de una muestra basal única, al menos en las etapas iniciales de su introducción.

3.2. MONITORIZACIÓN EN LOS PACIENTES SIN INDICACIONES DE TRATAMIENTO ANTIRRETROVÍRICO.

Si un paciente no es tratado con antirretrovíricos, sería recomendable su monitorización con carga vírica cada 4 o 6 meses (simultáneamente con recuento de linfocitos CD4), a menos que presente algún dato clínico de progresión de enfermedad.

3.3. MONITORIZACIÓN EN LOS PACIENTES QUE HAN INICIADO RECIENTEMENTE TRATAMIENTO ANTIRRETROVÍRICO.

Si se dispone de muestra basal previa al tratamiento y el paciente ha comenzado con su terapia antirretroviral, tal como se recoge en el Documento del Consejo Asesor Clínico (C.A.C.) del Plan Nacional sobre SIDA, se recomienda una determinación a los dos meses cuando la pauta es de dos análogos de nucleósidos, y a los 3 o 4 meses si la combinación incluye un inhibidor de proteasa. Tal como se especifica en dicho documento, esta determinación puede realizarse a los 3 meses, independientemente de la pauta utilizada, si ello facilita el seguimiento periódico de los pacientes.

3.4. MONITORIZACIÓN EN LOS PACIENTES EN TRATAMIENTO PROLONGADO CON ANTIRRETROVÍRICOS.

En un paciente tratado con fármacos antirretrovirales de forma estable se recomienda una determinación de carga vírica cada 4 meses, a menos que presente algún dato clínico de progresión. Si en un paciente se realiza un cambio terapéutico en función de sus datos clínicos, inmunológicos o virológicos, se recomienda una determinación previa de carga vírica, a los 2 meses cuando la pauta es de dos análogos de nucleósidos, y a los 3 o 4 meses si la combinación incluye un inhibidor de proteasas. Tal como se refiere previamente, puede realizarse de una forma uniforme a los 3 meses, independientemente de la pauta utilizada, si ello facilita el seguimiento periódico de los pacientes.

4. DETECCIÓN DE CARGA VÍRICA EN OTROS FLUIDOS CORPORALES.

Aunque la determinación de la CVP del VIH en muestras orgánicas diferentes al plasma no está estandarizada, en ocasiones su realización bajo condiciones especiales (estudios de investigación, petición expresa del clínico responsable) está justificada.

El LCR se puede procesar de manera similar al plasma. El VIH es un virus con marcado neurotropismo, por lo que su presencia en LCR es frecuente, aunque la concentración de virus en el SNC solo se correlaciona indirectamente con el daño neurológico.

Es posible adaptar las técnicas para la determinación de la carga viral en semen, muestras cervico-vaginales e incluso tejidos, aunque la viscosidad de estas muestras dificulta el proceso de extracción automática de los ácidos nucleicos. Este tipo de procedimientos son experimentales y los resultados deben interpretarse únicamente en el contexto en el que se realizan.

5. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.

El rango dinámico de replicación del virus generalmente comprende varios órdenes de magnitud por lo que se suelen emplean escalas logarítmicas para expresar los resultados. La mayoría de las técnicas expresan los datos en escala lineal y logarítmica.

La mayoría de los pacientes infectados que no reciben tratamiento tienen una CVP detectable en un rango muy amplio, que puede ser del orden de millones de copias/mL. Sin embargo, los pacientes en tratamiento antirretroviral después de las primeras 24 semanas, se espera que tengan una CVP inferior a 50 copias/mL. Si la CVP es detectable durante el tratamiento hay que considerar la falta de adherencia al tratamiento o el desarrollo de mutaciones de resistencia a los fármacos del tratamiento.

Además de durante la progresión natural de la infección la CVP puede aumentar durante situaciones en las que se produce un estímulo inmunológico, que aumenta la producción de partículas víricas por los linfocitos infectados. Esta situación se ha descrito en infecciones oportunistas activas y tras la administración de vacunas.

También se han descrito episodios cortos de aumento de la CVP conocidos como “Blips”, en pacientes con tratamiento antirretroviral y buen control virológico que mantienen CVP indetectable y presentan ocasionalmente viremia detectable de bajo nivel. Estos episodios aparecen en determinaciones aisladas y se limitan sin cambios en el tratamiento. Para que un incremento de la CVP sea considerado como blip debería ser inferior a 500-1.000 copias/mL y en la siguiente determinación debería ser de nuevo indetectable.

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