1. Ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI)
Los virus de la gripe poseen espículas de hemaglutinina, que aglutinan glóbulos rojos de diferentes especies animales. La unión del anticuerpo al sitio antigénico de la hemaglutinina bloquea la unión de la HA viral con los receptores de los eritrocitos; este efecto es conocido como inhibición de la hemaglutinación. Este bloqueo es específico y permite distinguir entre variantes antigénicas de un mismo subtipo. (Figura 1).
Figura 1: Fundamento del ensayo HI.
La prueba HI es la prueba recomendada (OMS) para la determinación de las características antigénicas de los virus en Programa mundial de Vigilancia de Gripe.
Protocolo
· Tratamiento de los sueros:
Los sueros se trataron con la enzima RDE (receptor destroying enzyme) que destruye inhibidores inespecíficos de la hemaglutinación que pueden producir falsos positivos al interaccionar con la hemaglutinina viral e inhibir la hemaglutinación de los eritrocitos.
Una vez descongelados los sueros, se mezclaron 100 µl del suero con 300 µl de RDE que se incubaron a 37 ºC durante 18 horas. Inmediatamente después la mezcla se incubó a 56ºC durante 30 minutos para desactivar la enzima RDE. Se añadieron 600 µl de PBS a cada suero (Dilución final: 1:10) y se mantuvieron a 4ºC hasta su utilización (máximo 4 días).
· Preparación de hematíes aviares:
Se usó una dilución de hematíes de pavo al 0,5 %. Se filtró aproximadamente 10 ml de sangre, con ayuda de una gasa estéril, en un tubo de 50 ml que contenía 45 ml de PBS. Se centrifugó 10 minutos a 1800 rpm a 4ºC. Se descartó el sobrenadante y se resuspendió el pellet en 50 ml de PBS. Se realizaron 4-5 lavados más (hasta que el sobrenadante de desecho fue claro). El pellet se resuspendió en un volumen de 12 ml y se realizó un hematocrito para calcular la concentración de hematíes de la dilución. Finalmente el concentrado de hematíes se diluyó hasta conseguir una concentración final de 0,5%.
· Titulación del antígeno hemaglutinante:
Antes de realizar el ensayo HI, el antígeno debe ser titulado con la finalidad de determinar su potencia hemaglutinante y ajustar la dilución del mismo para que contenga 8 unidades hemaglutinantes (HAU). Los antígenos usados fueron A/California/07/2009 (H1N1 pandémico) y A/Brisbane/59/2007 (H1N1 estacional). Éste último solo se enfrentó contra los sueros de la primera cohorte analizada.
En una placa de micro-titulación de 96 pocillos con fondo en V se añadieron 50 µl de PBS en la primera fila. Posteriormente se añadieron 50 µl del antígeno en el primer pocillo de la primera columna y se realizaron diluciones seriadas de 50 µl de uno a otro pocillo, desechando los últimos 50 µl. Se añadieron 50 µl de la solución de hematíes al 0,5% a todos los pocillos. Se tapó la placa, se agitó y se dejó incubando 30 minutos a temperatura ambiente. Pasado ese tiempo, se llevó a cabo la lectura y calculándose el título de cada antígeno. El título final corresponde a la dilución en la que hay una unidad hemaglutinante.
Se ajustó la dilución del antígeno, con PBS, para que contuviera 8 unidades hemaglutinantes en 50 µl y se repitió la titulación para comprobar las 8 (UHA).
· Determinación de título de anticuerpos de los sueros de los pacientes:
Una vez tratados los sueros y titulados los antígenos, se procedió a la reacción de inhibición de la hemaglutinación con los sueros de los pacientes. Para ello, se añadieron 25 µl de PBS en todos los pocillos de una placa de micro-titulación, exceptuando los de la primera columna, donde se dispensaron 50 µl del suero tratado (1:10). Se realizaron diluciones seriadas de los sueros. Tras las diluciones, se añadieron 25 µl de la dilución del antígeno con 8 UHA, se tapó, agitó y se mantuvo 15 minutos a temperatura ambiente. Trascurrido el tiempo, se añadieron 50 µl de la solución de hematíes al 0,5%, se volvió a tapar, se mezcló por agitación y se incubó a temperatura ambiente 30 minutos. Se introdujeron controles positivos (PBS+Virus+Hematíes) y negativos (PBS+Hematíes) y controles de suero (Suero+Hematíes) de hemaglutinación para comprobar que el ensayo se había realizado correctamente. Finalizado el tiempo de incubación se procedió a la lectura de la inhibición de la hemaglutinación en cada pocillo.
El título de HI corresponde a la última dilución de suero problema que inhibe completamente la hemaglutinación, considerándose títulos protectores de anticuerpos inhibidores de la hemaglutinación aquellos que sean mayores de 1/32-40.
2. Ensayo de microneutralización
La prueba de neutralización del virus de la gripe es un ensayo altamente sensible y específico para la identificación de anticuerpos neutralizantes. Se lleva a cabo en dos fases; una etapa de reacción virus-anticuerpo, seguida de la inoculación del virus en el sistema celular empleado. La ausencia de crecimiento vírico indica la presencia de anticuerpos neutralizantes específicos en un suero humano.
Protocolo
Este ensayo se realizó en el laboratorio del Dr. Kelvin en la UHN de Toronto, siguiendo un protocolo estandarizado. El protocolo se divide en tres pasos, la titulación del virus, el ensayo de neutralización y la detección de la proteína NP del virus gripal A por ELISA (Figura 2).
Figura 2: Representación esquemática del ensayo de microneutralización.
· Titulación del virus:
Se generó una muestra de virus con títulos muy elevados mediante cultivo del virus en cavidad alantoidea de huevos embrionados. Se determinó la actividad HA y la TCID50 del virus.
Se procedió a la titulación del virus siguiendo el esquema representado en la Figura 3.
Figura 3: Procedimiento para la titulación del virus gripal.
Se añadieron 1,5 x 104 células MDCK por pocillo que se incubaron toda la noche a 37 ºC en una atmosfera del 5% de CO2. Tras una serie de lavados con los tampones correspondientes, se fijaron las células con acetona al 80% diluida en PBS y se procedió a la realización de un ELISA para calcular la media de la absorbancia de las células control. La TCID50 del virus se calculó siguiendo el método Reed y Muench. Una vez calculada se diluyó la suspensión del virus para que 50 µl contengan 10 TCID50.
· Ensayo de neutralización del virus:
Los sueros de los pacientes se inactivaron a 56ºC durante 30 minutos. Durante el proceso de incubación se añadieron 50 µl del diluyente en todos los pocillos y 40 µl del mismo diluyente únicamente en la fila A (Figura 4). Transcurrido el proceso de incubación se dispensaron 10 µl (por duplicado) de cada suero en la columna correspondiente. Posteriormente se procedió a realizar las diluciones seriadas de los sueros (Figura 4).
Una vez preparada la placa, se dispensaron 50 µl de la suspensión que contenía el virus (2×102 TCID50/100 µl) en todos los pocillos, excepto en los controles negativos CC donde se añadieron 50 µl del diluyente. Los sueros se incubaron con el virus durante 2 horas a 37ºC en una atmosfera del 5% de CO2.
Transcurrido el proceso de incubación, se añadieron 1,5 x 104 células MDCK en cada uno de los pocillos, dejándolo incubar toda la noche a 37ºC en una atmosfera del 5% de CO2.
Tras el proceso de incubación, se retiró el medio de la placa, se lavaron los pocillos con 250 µl e incubando la placa durante 10 minutos a temperatura ambiente con 100 µl de la solución de fijación. Pasados los 20 minutos, la solución fijado se desechó y se dejó secar la placa al aire para proceder a la detección de NP mediante ELISA.
Figura 4: Procedimiento para la neutralización del virus
· ELISA para detección de NP
Una vez incubadas las muestras con la solución del virus y el suero, se realizaron 3 lavados con el buffer de lavado (PBS, 0.05% Tween-20). Se realizó la dilución del anticuerpo primario monoclonal (anti-influenza A pool NP) con el buffer de bloqueo (PBS, 1% BSA, 0.1% Tween-20) a una concentración 1:4000. Se añadieron 100 µl del anticuerpo a cada pocillo y se dejó incubar una hora a temperatura ambiente.Trascurrido el tiempo de incubación, se lavaron los pocillos con el buffer de lavado 4 veces, se diluyó el anticuerpo 2º (anti-mouse IgG conjugado con HRP) con el buffer de bloqueo en una relación 1:2000, añadiendo en cada pocillo de nuevo 100 µl del anticuerpo diluido. Se tapó la placa y se incubó 1 hora a temperatura ambiente.
Transcurrido el tiempo se lavó la placa 6 veces, y se añadieron 100 µl de substrato HRP en cada pocillo. Se incubó de 5 a 10 minutos a temperatura ambiente añadiendo la solución de parada (100 µl) en todos los pocillos. La placa se introdujo en el espectofotómetro y se leyó la absorbancia a 490 nm.
· Análisis para determinar el título de anticuerpos neutralizantes
| (Media del OD del suero) – (Media del OD del control negativo) + (Media del OD del control negativo) = X 2 |
Para considerar una actividad neutralizante positiva, el valor X debe ser menor del 50%.