El estudio virológico de los pacientes incluidos en el presente trabajo incluyó el diagnóstico directo específico de infección por virus de la gripe H1N1pm, la cuantificación de la carga viral en frotis nasofaríngeos y plasma, así como la secuenciación de los genes HA y NA del virus.
1. Diagnóstico virológico
El diagnóstico virológico se llevó a cabo en los Servicios de Microbiología de los hospitales participantes. El método de referencia para el diagnóstico del virus H1N1pdm fue el ensayo de RT-PCR, puesto a punto por el CDC. Este ensayo fue autorizado por la “Food and Drug Administration USA” (FDA) para detectar el genoma viral en muestras respiratorias de pacientes con sospecha de infección por el virus pandémico, siendo uno de los métodos diagnósticos más utilizado por los servicios participantes del estudio. Otro de los métodos utilizados para el diagnóstico del virus pandémico fue el “RealTime ready Influenza A/H1N1 Detection Set” de la casa comercial Roche.
Estas dos técnicas únicamente permitían detectar la presencia del virus H1N1pdm, sin embargo, durante los primeros meses de la aparición de la pandemia, el virus co-circuló con otros virus gripales A, por lo que se utilizó una tercera técnica, el panel de diagnóstico de virus respiratorios, basado en la tecnología Luminex. Este diagnóstico permite de una parte excluir la presencia de la mayor parte de virus respiratorios y otras cepas de gripe estacionales A y B.
Extracción de ácidos nucleicos
Independientemente de la técnica utilizada, la amplificación del genoma viral se llevó a cabo a partir de ácidos nucleicos extraídos de las muestras respiratorias recogidas en ambas cohortes de pacientes con sospecha de infección viral.
El procedimiento de extracción del ARN viral es importante ya que la eficacia del ensayo depende de la cantidad y calidad del ARN que se obtenga a partir de la muestra clínica. En ese sentido se utilizaron métodos de extracción de ARN automatizados que permiten la obtención de ARN altamente purificado. (Biomerieux® y Roche®), según el protocolo recomendado por los fabricantes (Figura 1).
Figura 1: Plataforma de extracción de ácidos nucleicos.
RT-PCR en tiempo real: Protocolo del CDC
Este ensayo consiste en una RT-PCR a tiempo real para la detección y caracterización -in vitro- del genoma de virus gripales de origen porcino y humano. Esto se lleva a cabo a través de un panel de cebadores oligonucleotídicos y de sondas fluorescentes doblemente marcadas (Taqman). El proceso se basa en la transferencia de energía fluorescente mediante resonancia (FRET) entre dos moléculas.
Las sondas de hidrólisis o sondas Taqman son oligonucleótidos de unión específica al ADN diana marcados con un fluorocromo donador (reporter) en el extremo 5′ que emite fluorescencia al ser excitado y un aceptor (quencher) en el extremo 3′ que absorbe la fluorescencia liberada por el donador.
Para que esto ocurra, las moléculas donadora y aceptora deben estar espacialmente próximas. Además, el espectro de emisión de la primera se ha de solapar con el espectro de absorción de la segunda. Mientras la sonda está intacta, la fluorescencia emitida por el donador es absorbida por el aceptor. Sin embargo, durante la amplificación, la Taq polimerasa gracias a su actividad 5′ exonucleasa, hidroliza el extremo libre 5′ de la sonda, produciéndose la liberación del fluorocromo donador. Como donador y aceptor se encontrarían espacialmente alejados, la fluorescencia emitida por el primero es captada por el lector (Figura 2).
Figura 2: Fundamento de las sondas Taqman.
Las sondas y cebadores utilizados en este ensayo se especifican en la Tabla 1.
Tabla 1: Secuencia de las sondas y cebadores utilizados en el protocolo del CDC.
| Sondas y cebadores | Secuencia (5´-3´) |
| InfA Forward | GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C |
| InfA Reverse | AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA |
| InfA Probe(1) | TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG |
| SW InfA Forward | GCA CGG TCA GCA CTT ATY CTR AG |
| SW InfA Reverse | GTG RGC TGG GTT TTC ATT TGG TC |
| SW InfA Probe(2) | CYA CTG CAA GCC CA”T” ACA CAC AAG CAG GCA |
| SW H1 Forward | GTG CTA TAA ACA CCA GCC TYC CA |
| SW H1 Reverse | CGG GAT ATT CCT TAA TCC TGT RGC |
| SW H1 Probe(2) | CA GAA TAT ACA “T”CC RGT CAC AAT TGG ARA A |
| RnaseP Forward | AGA TTT GGA CCT GCG AGC G |
| RnaseP Reverse | GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT |
| RnaseP Probe(1) | TTC TGA CCT GAA GGC TCT GCG CG |
1) Sondas Taqman marcadas en el extremo 5´con la molécula “reporter” 6-carboxyfluoreceina (FAM) y en el extremo 3´ con el “quencher Blackhole (BHQ1) de Biosearch Technologies (Inc.,Novato, CA).
2) Sondas Taqman marcadas en el extremo 5´con la molécula FAM y un quenched BHQ1 modificado para evitar su extensión por la Taq polimerasa.
El panel incluye un par de cebadores y la sonda fluorescente (InfA) diseñados para la detección universal de virus de la gripe A ya que amplifican el gen de la proteína M en todas los virus gripales A; un juego de cebadores y sonda (swInfA) que detectan el gen de la nucleoproteína (NP) de todos los virus de la gripe A de linaje porcino y por último un par de oligonucleótidos y la sonda fluorescente (swH1) con capacidad para detectar específicamente la hemaglutinina tipo 1 (H1) del nuevo virus Influenza A (H1N1) de origen porcino.
Este panel también incluye un control que permite estimar si la cantidad de la ARN en la muestra clínica es adecuada gracias un juego de cebadores y una sonda fluorescente que detectan específicamente el gen de la RNasa P (RP) humana y un control positivo (CP) diseñado para reaccionar con todos los cebadores y sondas incluidos en el panel.
Protocolo:
El protocolo está optimizado para RT-PCR en tiempo real en un solo paso y para un equipo con formato de placa de 96 pocillos. La plataforma utilizada en este ensayo fue Applied Biosystems TM real-time PCR 7500 (Figura 3)
Figura 3: Termociclador a tiempo real de Applied Biosystems TM real-time PCR 7500.
Una vez extraído el material genético de las muestras respiratorias, se preparó la mezcla de reacción en función del número de muestras a analizar (Tabla 2). La mezcla se homogenizó manteniéndose en frío hasta su utilización.
Tabla 2: Volúmenes necesarios para la reacción del protocolo del CDC.
| Reactivo | Volumen del reactivo para la reacción |
| Agua libre de nucleasas | N x 4.5 µl |
| Forward Primer | N x 0.5 µl |
| Reverse Primer | N x 0.5 µl |
| Sonda | N x 0.5 µl |
| SuperScript™ III RT/Platinum® Taq Mix | N x 0.5 µl |
| 2X PCR Master Mix | N x 12.5 µl |
| Volumen total | N x 20 µl |
Se utilizaron 20 µl de cada una de las mezclas de reacción en cada uno de los pocillos de la placa (Tabla 3).
Tabla 3: Diseño de la placa del protocolo del CDC.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | InfA | InfA | InfA | InfA | InfA | InfA | InfA | InfA | InfA | InfA | InfA | InfA |
| B | sw InfA | sw InfA | sw InfA | sw InfA | sw InfA | sw InfA | sw InfA | sw InfA | sw InfA | sw InfA | sw InfA | sw InfA |
| C | swH1 | swH1 | swH1 | swH1 | swH1 | swH1 | swH1 | swH1 | swH1 | swH1 | swH1 | swH1 |
| D | RP | RP | RP | RP | RP | RP | RP | RP | RP | RP | RP | RP |
| E | InfA | InfA | InfA | InfA | InfA | InfA | InfA | InfA | InfA | InfA | InfA | InfA |
| F | sw InfA | sw InfA | sw InfA | sw InfA | sw InfA | sw InfA | sw InfA | sw InfA | sw InfA | sw InfA | sw InfA | sw InfA |
| G | swH1 | swH1 | swH1 | swH1 | swH1 | swH1 | swH1 | swH1 | swH1 | swH1 | swH1 | swH1 |
| H | RP | RP | RP | RP | RP | RP | RP | RP | RP | RP | RP | RP |
Una vez añadida la mezcla y tras una agitación mecánica tipo vortex y una centrifugación corta en centrífuga eppendorf (spin de 5 seg) de los tubos que contenían los extractos de las muestras a analizar, los controles negativos y los controles positivos, se dispensaron 5 µl de cada una de ellos en el pocillo correspondiente. La placa se selló, se centrifugó para mezclar la muestra con la mezcla de reacción y se introdujo en el termociclador para la realización de la RT-PCR. Las condiciones del termociclador se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4: Programa del termociclador del protocolo del CDC.
| Ciclos | Temperatura (ºC) | Tiempo | Rampa | Adquisición | |
| Retrotrascripción inversa | 1 | 50 | 30 minutos | – | Ninguna |
| Activación Taq | 1 | 95 | 2 minutos | – | Ninguna |
| Amplificación | 45 | 95 | 15 seg | – | Ninguna |
| 55 | 30 | – | Simple |
Posteriormente se realizó la interpretación de los resultados con el software y las instrucciones que proporciona el fabricante. Una muestra se consideró positiva, si lo era tanto para el gen de la proteína M como para NP y H1 siendo los controles de la reacción conformes (positivos y negativos). Las muestras positivas solo para el gen M se analizaron para descartar otros virus de la gripe.
RT-PCR en tiempo real: “RealTime ready Influenza A/H1N1 Detection Set” (Roche)
Esta técnica consiste en una RT-PCR a tiempo real, mediante una combinación de cebadores y sonda de hidrólisis específicas para la detección de la proteína de la matriz viral (MP o M2) 1 y otro juego de cebadores y sonda específicos para la hemaglutinina (H1) del virus gripal pandémico 2. Las sondas en este ensayo están marcadas con FAM. En el equipo se proporciona un control positivo, tanto para el gen de la M2 como para el de la H1.
Se utilizó el sistema de la UDG (Uracil ADN-Glicosidasa) que elimina posibles amplicones presentes en el pocillo evitando contaminaciones. Este método consta de dos pasos: la incorporación de dUTP en todos los productos de la PCR y el tratamiento de las siguientes mezclas de PCR con uracil-ADN glycosylasa, seguido de una inactivación térmica de la UDG antes de realizar la PCR. De esta forma, la UDG degrada cualquier dUTP de cualquier amplicon previo presente en la reacción, antes de que la PCR tenga lugar.
Protocolo
El protocolo utilizado se optimizó para su uso en el termociclador LightCycler® 480 II (Figura 4).
Figura 4: Termociclador a tiempo real LightCycler® 480 II.
Una vez extraído el material genético de las muestras respiratorias, se preparó la mezcla de reacción, una para el gen de la proteína M2 y otra para el gen de la H1 teniendo en cuenta el número de muestras a analizar, los controles positivos (tanto para M2 como para H1) y los controles negativos. (Tabla 5). La mezcla se homogenizó manteniéndose en frío hasta su utilización.
Tabla 5: Reactivos y volúmenes necesarios para la reacción del protocolo de Roche.
| Reactivos para H1 | Volumen/Muestra | Reactivos para M2 |
| Agua libre de nucleasas | 2,6 µl | dH20 |
| Enzyme Blend 50X | 0,4 µl | Enzyme Blend 50X |
| Reaction Buffer 5X | 4 µl | Reaction Buffer 5X |
| Reagent Mix* H1 | 3 µl | Reagent Mix* M2 |
| UDG | 0,025 µl | UDG |
| Volumen total | 10,025 µl | Volumen total |
* Los Reagents Mix son mezclas de primers y sondas para cada uno de los genes a estudio (H1 y M2).
Se dispensaron 10 µl de cada una de las mezclas de reacción en todos los pocillos de la placa. Una vez añadida la mezcla y tras la aplicación de un vortex y un spin a los tubos con los extractos de las muestras, se añadieron 10 µl de cada una de ellas en el pocillo correspondiente, uno para el gen H1 y otro para el M2. De la misma manera se añadieron 10 µl de agua libre de nucleasas en dos pocillos extra como control negativo. Para confirmar la eficiencia de la RT-PCR, se añadió un control positivo para el gen M2 y otro para el gen H1, diluidos en agua libre de nucleasas a una concentración final de 1:10. La placa se selló, se centrifugó para mezclar la muestra con la mezcla de reacción y se introdujo en el termociclador (Tabla 6).
Tabla 6: Programa del Termociclador RT-PCR (Roche).
| Programa | Ciclos | Segmento | Tº | Tiempo | Modo de adquisición |
| Transcripción reversa | 1 | 95º | 8:00 | None | |
| UDG | 1 | 40º | 10:00 | None | |
| 95º | 5:00 | None | |||
| Amplificación | 45 | Desnaturalización | 95º | 0:01 | None |
| Anillamiento | 60º | 0:20 | Single | ||
| Elongación | 72º | 0:01 | None | ||
| Refrigeración | 1 | 40º | 0:30 | None |
La lectura e interpretación se realizó mediante el software del fabricante (Figura 5). Una muestra se consideró positiva, si lo era tanto para el gen que codifica la proteína M2 como para el gen gen H1 siendo los controles de la reacción conformes (positivos y negativos). Las muestras positivas solo para el gen M2 se analizaron para descartar otros virus de la gripe.
Figura 5: Resultados y software de análisis del LightCycler® 480 II
Panel de detección de virus respiratorios (Luminex)
El método consiste en una prueba cualitativa para la detección simultánea y la identificación del genoma de múltiples virus respiratorios a partir de muestras respiratorias.
El ensayo utiliza una tecnología denominada xMAP®, fundamentada en una PCR múltiple que origina productos de amplificación de cada uno de los virus o subtipos de virus presentes en la muestra. Cada producto de PCR se trata con fosfatasa alcalina de camarón (SAP), para inactivar los nucleótidos restantes y con exonucleasa I (EXO), para degradar los cebadores que queden aún de la reacción RT-PCR.
A continuación se utiliza la técnica de TSPE multiplex para detectar el ADN vírico presente en la muestra. Se utiliza ADN polimerasa que sólo elongará el cebador cuando se produzca una unión perfecta en el extremo 3’, de forma que el cebador sólo se elongará si su ADN diana está presente en la muestra. Si se produce la elongación, se añaden los dCTP marcados con biotina a la cadena elongada.
Después de la TSPE, la reacción se añade directamente a los micropocillos que contienen esferas y anti-colas (anti-tags) inmovilizadas, que son complementarias a las colas de las secuencias de los cebadores. Las esferas que contienen las anti-colas se pueden distinguir espectralmente unas de las otras. Un marcador fluorescente (estreptavidina-ficoeritrina) se une a la biotina en los cebadores elongados. Cada cebador con cola hibrida únicamente con la anti-cola complementaria; por lo tanto, cada esfera coloreada representa un virus específico, mediante el complejo esfera/anti-cola/cebador con cola. Las esferas se analizan en el sistema LX100/200.
La lectura se lleva a cabo con un equipo Luminex cuya tecnología se basa en la citometría de flujo. El sistema LX100/200 tiene dos láseres: uno identifica la esfera coloreada y el otro identifica la presencia o la ausencia del cebador elongado mediante el marcador ficoeritrina. De esta manera, la presencia de un virus en la muestra se identifica mediante la presencia de la señal de la ficoeritrina unida al cebador específico para ese virus. Los datos generados por el sistema LX100/200 se analizan mediante el software para el análisis de datos xTAG Data Analysis Software RVP-I (TDAS RVP-I) con el fin de obtener un informe de los virus presentes en la muestra.
Este ensayo dispone de un control interno (bacteriófago MS2) y un control de ejecución (bacteriófago lambda de ADN) para garantizar el funcionamiento adecuado del ensayo.
Los tipos y subtipos de virus detectados por este ensayo se enumeran en la tabla 7.
Tabla 7: Virus respiratorios detectados por el método Luminex.
| Virus | Subtipos |
| Gripe A | H1,H3 & H5* |
| Gripe B | No subtipable |
| RSV A | – |
| RSV B | – |
| CoronavirusSARS*, NL63, 229E, OC43 y HKU1 | – |
| Parainfluenza (1,2,3 y 4) | – |
| Metapneumovirus | – |
| Entero/Rhinovirus | No subtipable |
| Adenovirus | No subtipable |
| MS-2/Lambda | |
| TOTAL | 21 |
Protocolo
El ensayo de Luminex se llevó a cabo en 6 pasos (Figura 7):
Figura 7: Esquema de los 6 pasos del panel de detección de virus respiratorios.
· 1º paso: Extracción de los ácidos nucleicos: Antes de la extracción automatizada, se añadió el control interno. La extracción en este caso se realizó en la plataforma EasyMag de Biomerieux®.
· 2º paso. RT-PCR múltiple: Se aplicó un vórtex y un spin a todos los reactivos antes de su utilización procediendo a la preparación de la mezcla de reacción siguiendo el orden que se indica en la Tabla 8.
Tabla 8: Volúmenes necesarios para la primera reacción de Luminex panel de virus respiratorios.
| Reactivo | Volumen para una reacción |
| xTAG RNase-free Water | 1,3 µL |
| xTAG OneStep Buffer, 5X | 4,0 µL |
| xTAG dNTP Mix | 1,1 µL |
| xTAG RVP FAST Primer Mix | 2,0 µL |
| xTAG OneStep Enzyme Mix | 1,6 µL |
| Volumen total | 10, 0 µL |
· 3er paso: Multiplex TSPE: antes de proceder a la hibridación de las muestras se aplicó un vórtex y un spin a la estreptavidina xTAG y el conjugado de R-ficoeritrina G15 (SAPE). El SA-PE se diluyó 75 veces con el xTAG Reporter Buffer en un tubo de polipropileno.
En la tabla 9 se detalla el cálculo de los volúmenes por reacción (incluyendo sobrecargos) para la reacción de hibridación.
Tabla 9: Volúmenes necesarios para la segunda reacción de Luminex de virus respiratorios
| Número de reacciones de hibridación | Volumen de xTAG Reporter Buffer (mL) | Volumen de SA-PE (µL) |
| 24 | 2,22 | 30 |
| 48 | 4,44 | 60 |
| 96 | 8,88 | 120 |
· La mezcla de reacción se homogenizó mediante vórtex y spin y posteriormente se añadieron 10 µl de la mezcla en cada uno de los tubos de PCR y 10 µl de muestra extraída (incluyendo dos tubos con ADN Lambda como control positivo y agua libre de RNasas como control negativo). Una vez homogenizada la mezcla, se introdujeron en un termociclador convencional (eppendorf) siguiendo las condiciones especificadas por el fabricante. (Tabla 10).
Tabla 10: Programa del termociclador para el protocolo Luminex de virus respiratorios.
| Ciclos | Temperatura (ºC) | Tiempo | |
| Precalentamiento | 1 | 50 | 20 minutos |
| Desnaturalización | 1 | 95 | 15 minutos |
| Amplificación | 34 | 95 | 30 segundos |
| 59 | 30 segundos | ||
| 72 | 30 segundos | ||
| Elongación | 1 | 72 | 2 minutos |
| Terminación | 4 | Mantenido |
· 4º paso: Hibridación y detección con las micro-esferas: Se aplicó un vórtex al reactivo que contenía la mezcla de esferas, y se sonicó durante 10 segundos en una bañera de ultrasonidos para dispersar las microesferas. Este proceso se repitió una vez más. Se dispensaron 20 µl de la mezcla en todos los pocillos de una placa de microtitulación, incorporándose 2 µl del producto de la RT-PCR en los pocillos correspondientes.
· Se añadió la solución SA-PE diluida en una bañera y utilizando una pipeta multicanal se dispensaron 75 µl de la solución en cada pocillo, homogeneizando la reacción. La placa se selló y se introdujo en el termociclador a 45ºC durante 20 minutos.
5º paso: Adquisición de datos: Tras la hibridación se destapó la placa y se introdujo en el aparato de lectura iniciándose así la adquisición de datos (Figura 8).
Figura 8: Plataforma Luminex
· 6º paso: Análisis de los datos: El software TDAS RVP analiza los datos proporcionando un resumen de los virus detectados en cada muestra (Figura 9).
Figura 9: Software de análisis TDAS RVP.
2. Cuantificación de la carga viral
La cuantificación de la carga viral tanto en plasma como en los lavados nasofaríngeos, se llevó a cabo en el Centro Nacional de Gripe de Barcelona 3. Se realizó una primera RT-PCR con un set de cebadores y sondas específicos para el gen que codifica la proteína viral de la matriz, M1. Para poder conocer la concentración obtenida, se construyó una curva estándar a partir de los valores umbrales del ciclo obtenidos a partir de diluciones seriadas de un ARNc control. Este ARNc control fue desarrollado en el mismo laboratorio del Dr. Tomás Pumarola, a partir de un producto de PCR clonado en un plásmido.
El límite de detección fue de 1,86 log10 copias/reacción con una eficiencia de 98,3% (datos no mostrados).
Con el fin de modular la carga viral detectada en relación con la calidad de las muestras recogidas, se realizó una segunda PCR a tiempo real para detectar y cuantificar las copias del gen humano que codifica para la RNasa. Puesto que hay dos copias del gen de la RNasa P por célula humana, la cantidad de células en la muestra se puede inferir con una dilución seriada de ADN genómico humano de concentración conocida obtenida a partir de células mononucleares de sangre periférica. El límite de detección de este ensayo fue de 9 células con una eficiencia del 95,9%.
3. Mutaciones el virus pandémico y resistencia antiviral.
Como ya se ha comentado en la introducción, una de las mutaciones más importantes del virus de la gripe pandémica es la H274Y del gen de la Neuraminidasa, que aporta resistencia al oseltamivir y la mutación D222G/N en el gen de la HA.
Para evaluar la presencia de la mutación H274Y se utilizó un equipo comercializado por Roche, LightMix Kit Influenza A virus HxN1 Tamiflu resistance [H274Y], y la secuenciación de este mismo gen. En el caso de la mutación D222G/N, se secuenció el gen de la HA viral.
RT-PCR: LightMix Kit Influenza A virus HxN1 Tamiflu resistance [H274Y]
La causa más frecuente de resistencia al oseltamivir en los virus N1 es un cambio de base C/T que se traduce en la sustitución de Histidina en la posición 274 por Tirosina.
El método se basa en la capacidad de detectar ADN de doble cadena por fluoresecencia, monitorizando la formación de amplicones durante los ciclos de amplificación y realizando un análisis de curvas de fusión (conocidas como curvas melting). Las curvas de melting permiten de una forma muy estable, detectar mutaciones o polimorfismos. Basándose en su temperatura de melting específica, este análisis puede discriminar rápidamente entre productos específicos, dímeros de primers y otros artefactos.
Este equipo utiliza una sonda específica que reconoce las bases correspondientes tanto en el virus H1N1 estacional como en el pandémico. Cuando la sonda esta libre en solución, la emisión de fluorescencia está atrapada por un aceptor específico no fluorescente. Sin embargo cuando la sonda hibrida con su diana, se reduce el aceptor y el donador emite fluorescencia.
En este caso, las sondas tienen una temperatura de fusión constante (55ºC) para cualquier virus sensible al oseltamivir. La disminución de la temperatura de melting indica la variación de una base en la región que se encuentra entre los aminoácidos Pro 271 y Cys 280 lo que demuestra la presencia de virus resistente (Figura 10).
Figura 10: Variación de la temperaturas de fusión de la sonda.
El equipo tiene dos controles, una cepa salvaje (wt) y un control para la cepa mutada (mt) de forma que se puedan comparar con las muestras problema.
Protocolo
Este equipo esta optimizado para la plataforma LightCycler® 2.0, un termociclador en tiempo real basado en un sistema de capilares (Figura 11).
Figura 11: Plataforma LightCycler® 2.0
Se trata de una PCR a tiempo real llevada a cabo en dos pasos: la síntesis de ADN complementario (ADNc) mediante una retrotranscripción y la amplificación de detección de la sonda para discriminar entre las cepas salvajes y las cepas mutadas.
· Síntesis de ADNc
A partir del extracto de ácidos nucleicos se realizó la síntesis de ADNc. Para ello se preparó la mezcla de reactivos según lo especificado en la tabla 11. Esta mezcla se incubó durante 10 minutos en un termociclador a 65º, manteniéndose a 4º hasta su utilización.
Tabla 11: Volúmenes necesarios para la reacción el primer paso del protocolo de resistencia H275Y.
| Reactivo | Volumen para una reacción |
| dH2O RNase-free Water | 6 µL |
| Random Hexamer Primers | 2 µL |
| ARN | 5 µL |
Tras el proceso de incubación se generó la master mix de la RT, incorporándose la mezcla resultante a los reactivos previamente incubados. Los volúmenes de la master mix y el programa del termociclador utilizados para la síntesis de ADNc se detallan en las Tablas 12 y 13.
Tabla 12: Volúmenes necesarios para la master mix de la RT del protocolo de resistencia H275Y.
| Reactivo | Volumen para una reacción |
| Transcriptor RT-Reaction Buffer 5X | 4 µl |
| dNTP-mix | 2 µl |
| Protector Rnase inhibitor | 0,5 µl |
| Reverse Transcriptase | 0,5 µl |
Tabla 13: Programa del termociclador para la RT del protocolo de resistencia H275Y.
| Ciclos | Temperatura (ºC) | Tiempo | |
| Preincubación | 1 | 25 | 10 minutos |
| Incubación | 1 | 55 | 30 minutos |
| Inactivación | 1 | 85 | 5 minutos |
| Terminación | 1 | 4 | Mantenido |
· Amplificación y detección de las cepas mutadas-wt
Se preparó la mezcla de reacción para la amplificación del ADNc según la Tabla 14. La mezcla resultante se cargó en cada uno de los capilares, sellándose y centrifugándose durante 2-5 segundos a 4ºC para garantizar la homogenización y disposición de la reacción dentro del capilar. El programa del termociclador utilizado para la amplificación se detalla en la Tabla 15.
Tabla 14: Volúmenes necesarios para la PCR protocolo de resistencia H275Y.
| Reactivo | Volumen para una reacción |
| dH2O RNasa free | 8,6 µl |
| MgCl2 | 2,4 µl |
| Reagent Mix* | 2 µl |
| Roche Maste | 2 µl |
| ADNc/control positivo/ control negativo | 5 µl |
| Volumen total | 20 µl |
*Se trabaja con el Reagent Mix en oscuridad para evitar que las sondas se degraden.(LightCycler FastStart DNA Master Hyprobe)
Tabla 15: Programa del termociclador para la PCR protocolo de resistencia H275Y.
| Modode análisis | Cycles | Target(ºC) | Enfriamiento(hh:mm:ss) | Ramp Rate (ºC/s) | Modo de Adquisición | |
| Desnaturalización | Ninguno | 1 | 95 | 0:10:00 | 4.4 | Ninguno |
| 95 | 0:00:15 | 4.4 | Ninguno | |||
| Amplificación | Cuantificación | 45 | 62 | 0:00:15 | 4.4 | Simple |
| 72 | 0:00:20 | 4.4 | Ninguno | |||
| 95 | 0:00:30 | 4.4 | Ninguno | |||
| Fusión | Curva de Fusión | 1 | 40 | 0:00:30 | 4.4 | Ninguno |
| 85 | 0:00:00 | 0.2 | Continuo | |||
| Enfriamiento | Ninguno | 1 | 40 | 0:00:30 | 2.2 | Ninguno |
Una vez terminado el programa del termociclador, se procedió al análisis de las curvas de melting para determinar si existía o no alguna cepa resistente respecto a los controles positivos (Figura 12).
Figura 12: Análisis de las curvas de melting para la identificación de la mutación H275Y
Secuenciación.
La secuenciación se llevó a cabo en el Centro Nacional de Gripe de Barcelona utilizando la plataforma ABI 3130XL. Se secuenció un fragmento de 1296 bases del gen de la neuraminidasa correspondiente a la cepa A/California/04/2009 para evaluar la presencia de la mutación H274Y en ese mismo gen y un fragmento del gen de la hemaglutinina de esta misma cepa, para la detección de la mutación D222G/N 4.
Referencias
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2. Panning M, Eickmann M, Landt O, et al. Detection of influenza A(H1N1)v virus by real-time RT-PCR. Euro Surveill. Sep 10 2009;14(36).
3. Anton A, Lopez-Iglesias AA, Tortola T, et al. Selection and viral load kinetics of an oseltamivir-resistant pandemic influenza A (H1N1) virus in an immunocompromised patient during treatment with neuraminidase inhibitors. Diagn Microbiol Infect Dis. Nov;68(3):214-219.
4. Anton A, Marcos MA, Martinez MJ, et al. D225G mutation in the hemagglutinin protein found in 3 severe cases of 2009 pandemic influenza A (H1N1) in Spain. Diagn Microbiol Infect Dis. Jun;67(2):207-208.