5.1. ESPECTRO DE FLUORESCENCIA
5.3. MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA
5.3.2. PRINCIPIOS GENERALES DE MARCACIÓN DE ANTICUERPOS POR SUSTANCIAS FLUORESCENTES
5.3.3. TIPO DE INMUNOFULERESCENCIA
5.3.4. INFLUENCIA DEL TIPO DE ANTICUERPO.
5.4. REACCIONES DE INMUNOFLUORESCENCIA EN FASE SOLUBLE.
5.4.1. INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (IFD).
5.4.2. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI).
5.4.3. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA AMPLIFICADA POR COMPLEMENTO.
5. FLUORESCENCIA
Es el resultado de un proceso en tres etapas que ocurre en algunas moléculas (fluoróforos)
1°: Excitación: se entrega un fotón de energía por una fuente externa a un fluoróforo que absorbe, pasando a un estado electrónico excitado S1’
2°: Duración del estado excitado: existe por un período de tiempo finito (típicamente 1-10 x 10-9 segundos), sufre cambios conformacionales y puede interaccionar con su ambiente molecular. Consecuencias: La energía de S1’ es parcialmente disipada produciendo un estado excitado relajado desde el que se emite la fluorescencia; no todas las moléculas inicialmente excitadas del estado 1 vuelven al estado S0 por fluorescencia, existen otros procesos.
3°: Emisión de fluorescencia: un fotón se emite, lo que permite el retorno al fluoróforo al nivel S0. A causa de la disipación de energía durante el estado excitado, la energía de este fotón es menor.
La diferencia de energía es llamada “Stokes shift” (h?EX – h?EM) que es fundamental para la sensibilidad de las técnicas de fluorescencia, ya que la emisión del fluoróforo permite distinguirse del background.
5.1. ESPECTRO DE FLUORESCENCIA
– El mismo fluoróforo puede ser repetidamente excitado y detectado. Para moléculas poliatómicas en solución las transiciones electrónicas son reemplazadas por un espectro de energía llamado espectro de excitación de fluorescencia y de emisión. El ancho de banda del espectro es un parámetro importante para cuando dos fluoróforos son detectados simultáneamente.
– El espectro de emisión de fluorescencia es independiente de la longitud de onda a la cual se excita. La intensidad de emisión es proporcional a la amplitud del espectro de excitación a la longitud de onda de excitación.
– Para una intensidad satisfactoria de fluorescencia es preciso que se utilicen como excitadoras radiaciones de longitud de onda correspondientes a los máximos de absorción del fluoróforo.
– Los espectros de absorción y de fluorescencia de un fluoróforo en general están próximos (l más cortas y l más largas respectivamente). Esto es importante en la elección de los filtros.
— La intensidad de la señal depende de los mismos parámetros que la absorbancia, aunque también de la fuente de excitación (comúnmente un láser de ion argón, longitud de 488 nm) y de la eficiencia de recolección del detector.
– Las muestras biológicas marcadas con fluorescencia contienen típicamente más de una especie fluorescente, haciendo que el aislamiento de la señal sea compleja. Otras señales ópticas (como S2) quizás correspondan al background o a una segunda sonda fluorescente.
– La detección de autofluorescencia puede ser minimizada por la selección de filtros adecuados que reduzcan la transmisión de E2 respecto de E1.
– Quenching de fluorescencia: En muestras biológicas el fluoróforo está en solución y puede interaccionar con otras moléculas. Como consecuencia de esta interacción se puede producir una perdida de emisión fluorescente. Es un proceso de desexcitatción no radiativa provocado por una molécula ajena al fluoróforo (compuestos no fluorescentes), que recibe el nombre de quencher. Al proceso se lo denomina «quenching» de la fluorescencia
5.2. ELECCIÓN DEL FLUOROCROMO
– La elección de un fluorocromo dependerá de una serie de factores. Si se necesita un único color el fluorocromo de elección será el FITC. El FITC es barato, tiene un alto rendimiento cuántico y es relativamente hidrofílico. La rápida pérdida de la fluorescencia bajo una intensa iluminación ultravioleta puede ser solucionado por el añadido al preparado de fenilen diamina o n-propil galato, sin embargo estos reactivos son tóxicos para células vivas. El derivado triazínico de la fluoresceína, el dicloro-triazinilamino fluoresceína (DTAF) posee propiedades ópticas muy similares al FITC pero es mucho más estable.
– El segundo fluorocromo más popular es el isotiocianato tetrametil de rodamina (TRITC), que es mucho más fluorescente que el isotiocianato de rodamina. La intensa fluorescencia roja del TRITC es fácilmente distinguible de la verde del FITC. Debido a ello por varios años fueros los dos fluorocromos de elección para experimentos con fluorescencia combinada. La pérdida de la fluorescencia del TRITC es mucho menor que la FITC.
5.3. MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA
– La luz de una fuente de longitud de onda múltiple se mueve a través de un filtro excitador que sólo permite que pase la radiación excitada de la longitud de onda deseada. Esta radiación es reflejada por el filtro dicromático y enfocada por la lente del objetivo sobre la muestra, las moléculas fluorescentes de la muestra se excitan y emiten luz (por fluorescencia) de una longitud de onda específica y mayor. Esta luz es enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a través del filtro dicromático y no se refleja. Un filtro de barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia de la radiación de excitación.
– Fuente luminosa: coincidente con espectro de absorción del fluorocromo. Que no llegue al ocular (UV perjudica la retina) Luz monocromática o no.
– Filtros:Excitador: Transparente a l cortas bloqueando l más largas. Barrera: Transparente a l largas bloqueando l cortas. Se coloca entre el objeto y el observador.
5.3.1. FUNDAMENTO.
Consiste en conjugar colorantes fluorescentes con anticuerpos, exponiendo después este conjugado a los anticuerpos o antígenos correspondientes en cortes de tejidos, frotis de microorganismos o de células, o cultivo de tejidos en capa única. Cuando la reacción es positiva y se expone a la luz ultravioleta se producirá fluorescencia observable bajo el microscopio de inmunofluorescencia. Se realiza un acople a un anticuerpo de un fluoróforo o una enzima que cataliza una reacción por la cual se emite fluorescencia
5.3.2. PRINCIPIOS GENERALES DE MARCACIÓN DE ANTICUERPOS POR SUSTANCIAS FLUORESCENTES
A) Conjugados
Compuestos fluorescentes + Anticuerpos = Conjugados
Un buen conjugado debe tener:
– Fluorescencia intensa
– Reacción específica con los antígenos
Depende de:
– Calidad y concentración de los Acs en el suero
– Propiedades de la sustancia fluorescente
– Modificaciones que ambos pueden sufrir en el acople
También influyen:
– Intensidad de marcación
– Homogeneidad de marcación
– Presencia en el conjugado de otras moléculas marcadas
B) Anticuerpos
– Para mayor especificidad utilizar antígenos puros para inmunizar
– Absorber los antisueros para eliminar Acs indeseables o naturales
– Purificar la fracción de Ig a marcar
– Verificar título de anticuerpos
– Existe un estrecho paralelismo entre título precipitante y fluorescente
– Titulación de reactivos: Ac 1° y Conjugado deben titularse.
C) Fluorocromos
-El fluorocromo no unido se dializa o se separa por filtración en geles. Disponibilidad filtros
D) Intensidad de marcación
– Fluorocromo puede ser conjugado en un número variable a cada molécula de proteína, resultando diferentes grados de marcación.
– Mayor intensidad de marcación, mayor intensidad
– Marcación excesiva:
– Disminución del PI de las proteínas
– Alteraciones en las propiedades inmunológicas de los anticuerpos (6 ó 7 moléculas de fluoresceína/ molécula de Ac es el límite máximo)
– Quenching de fluorescencia (disminución del rendimiento de emisión)
E) Homogeneidad de marcación
– Altamente marcadas: Fluorescencia inespecífica
– Medianamente marcadas: Resultados más satisfactorios
– Insuficientemente marcadas: Fluorescencia poco intensa
5.3.3. TIPO DE INMUNOFULERESCENCIA
5.3.4. INFLUENCIA DEL TIPO DE ANTICUERPO.
| Ac Policlonal | Ac Monoclonal | Pool de Ac monoclonales | |
| Fuerza de señal | Excelente | Regular a Buena | Excelente |
| Especificidad | Buena, pero a veces el background es alto | Excelente pero con posible reacción cruzada | Excelente |
|
Ventajas
Desventajas |
Señal fuerte No renovable Background Se necesita titular |
Específico Baja señal |
Señal fuerte Específico Disponibilidad |
5.4. REACCIONES DE INMUNOFLUORESCENCIA EN FASE SOLUBLE.
- Es una técnica CUALITATIVA que se usa para detectar la presencia de Ac específicos en el suero.
- En esta técnica la visualización del IC no es directa, sino que se lleva a cabo por intervención de sustancias fluorescentes acopladas a un Ac o anti-Ac, que recibe el nombre genérico de conjugado fluorescente. Los Ag utilizados son formes o partículas (cortes de tejidos, bacterias, parásitos o cortes de parásitos, etc).
5.4.1. INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (IFD).
Se añade la solución de Ac fluorescente sobre el Ag, previamente fijado en un porta o placa, se incuba, se lava y se leen los resultados.
5.4.2. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI).
El suero problema (con el Ac buscado) se aplica sobre el Ag fijado, se lava y luego se añade el anti-Ac fluoresceinado contra la región Fc del primero, se lavan y se leen los resultados.
Se usa de rutina para detectar auto-Ac en sangre de pacientes con enfermedades autoinmunes.
5.4.3. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA AMPLIFICADA POR COMPLEMENTO.
Se usa para detectar Ac fijadores del complemento. En el segundo paso, después de añadir el Ac, se añade complemento fresco, que se fija alrededor de donde se han fijado los Ac. Debido a los pasos de amplificación de la vía clásica del complemento, una molécula de Ac puede fijar muchas moléculas de C3b al Ag, que se revelan con Ac anti C3b fluoresceinado. Es una técnica mucho más sensible.
En los tres casos, los IC formados se ponen de manifiesto por observación del porta en un microscopio provisto de luz ultravioleta (los Ac se ven con fluorescencia verde). El patrón de fluorescencia es característico de cada Ag.