Medios de cultivo

Generalidades

• Medio artificial preparado mediante la mezcla de componentes purificados o de soluciones orgánicas complejas.
• El medio de cultivo estará formado por cuatro elementos:

1. la naturaleza del sustrato o fase en que crecen las células.

2. las condiciones físico-químicas y fisiológicas del medio.

3. la naturaleza y composición de la fase gaseosa.

4. las condiciones de incubación, especialmente la humedad y la temperatura.

• Según si la línea celular precise o no unirse al sustrato para proliferar se dice que es dependiente o independiente de anclaje.
  • Células en monocapa: capa de células crecidas sobre una superficie.
    • Hay células que para crecer necesitan una superficie de adhesión.
    • Morfología de fibroblastos o peitelial
  • Células en suspensión:
    • Hematopoyéticas, transformadas o tumores malignos.
    • Morfología redondeada.

Materiales usados como sustrato

• Plástico desechable
  • Muy empleado en la actualidad como material desechable estéril por irradiación.
  • El plástico más empleado es el poliestireno, de buena calidad óptica. Debido a que este plástico es hidrofóbico requiere un tratamiento mediante irradiación-gamma, químico, o mediante descargas eléctricas que produzca una superficie mojable.
  • El tratamiento es característico de las diferentes suministradores, y por ello los productos varían en calidad de uno a otro.
  • Es recomendable probar muestras de distintos orígenes y medir la eficacia de plaqueo y las tasas de crecimiento para maximizarlas especialmente en aquellas líneas celulares de crecimiento difícil.
  • Otros plásticos que se emplean son polivinil-cloruro, policarbonato (PVC), politetrafluoretileno (teflón, PTFE), thermanox (TPX).
  • Actualmente es de gran interés, especialmente para el cultivo de células epiteliales polarizadas, el uso de membranas plásticas porosas.

• Vidrio: tiene como ventajas su escaso coste y su facilidad de limpieza y esterilización. Asimismo es especialmente útil para su posterior observación al microscopio por su calidad óptica
• Microsoportes («microcarriers»): Se trata de soportes plásticos (poliestireno, Nunclon, GIBCO), sephadex (Flow Lab. y Pharmacia) y poliacrilamida (BioRad) en forma de pequeñas bolas («beads») a las que se unen las células dependientes de anclaje. Estas bolas con las células adheridas se mantienen en suspensión.
• Matrices tridimensionales: Son sustratos en los que las células penetran, estableciendo una distribución tridimensional (geles de colágeno, esponja de celulosa sola, etc.). En estas matrices muchos tipos celulares crecen y se establecen de una manera análoga a como lo hacen en el tejido de origen.
• Sustratos no adherentes: Son sustratos que no permiten la adhesión celular, por ejemplo agar, agarosa, o methocel (metilcelulosa de alta viscosidad). Son de utilidad en situaciones en las que no conviene que exista dispersión de las células derivadas de una originaria, por ejemplo en los procesos de aislamiento de colonias infectadas por virus.
• Interfases líquido-gel o líquido-líquido: se desconocen exactamente los mecanismos

• Haces microcapilares permeables
  • Son cámaras de crecimiento de células formadas por un recipiente cilíndrico en el que se siembra, y en el interior del cual hay un haz de capilares plásticos permeables adecuados para que las células se adhieran.
  • Los capilares se encuentran conectados a un circuito de recambio del medio.
  • Este dispositivo ofrece una gran superficie de crecimiento apta para el crecimiento celular, y un eficaz sistema de recambio del medio.
• Superficies tratadas
  • La adherencia y crecimiento de las células en un frasco mejora en muchos casos si la superficie ha sido tratada con el medio de crecimiento de otro cultivo, debido a la presencia de colágeno o fibronectina liberada por las células, o bien sobre superficies recubiertas de proteínas de matriz extracelular (fibronectina, colágeno, vitronectina, Matrigel, etc…).
  • Se pueden tratar los recipientes de cultivo con fibronectina (1 ngr/ml) añadido al medio, o con colágeno desnaturalizado (células epiteliales).
  • n El tratamiento de las superficies con compuestos biológicamente activos pueden inducir alteraciones específicas de la adhesión o el comportamiento celular.

• • Las interacciones célula-matriz extracelular son determinantes en la regulación de la proliferación y la diferenciación. Hay métodos para la reconstitución de membranas basales con la finalidad de optimizar las condiciones de diferenciación celular.

• «Feeder layers»
  • Se ha descrito previamente que algunos tipos celulares para crecer en cultivo y expresar sus características diferenciadas precisan de suplementos específicos.
  • Una manera de obtener estos suplementos es la de hacerlos crecer sobre los restos de monocapas de otros tipos celulares.
  • Estas monocapas previas se esterilizan o se inhibe su crecimiento (normalmente por irradiación X o gamma).
  • Este efecto podría ser debido a dos posibilidades : suplementación del medio, o modificación del sustrato.
  • Una de las monocopas más empleadas son los fibrobastos de ratón 3T3 irradiados.

Recipientes de cultivo:

• Placas de Petri (ventiladas)
  • Disponibles en 3 tamaños : 3.5, 6.0 y 10 cm de diámetro son las más empleadas cuando se trata de crecer las células para usar directamente en experimentos. No es recomendable, por su escasa estanqueidad, emplearlas para el mantenimiento de líneas.

• Multiplacas

• • Es una variante de las placas de Petri. Placas de varios pocillos, desde 6 a 96 pocillos:
    • Fondo plano.
    • Fondo en “U”

• Frascos de Roux (botellas ventiladas o no)

• • Disponibles en diferentes tamaños.
  • Son recomendables para el mantenimiento de las líneas y la producción de células, o bien para el crecimiento de células en suspensión.

• «roller bottles»
  • Se trata de tubos, con una cara plana sobre la que se fija el cultivo, y que se incuban en los incubadores dotados de «roller».
  • Existen variantes con una gran superficie de adhesión (espirales de plástico…) y que se destinan a la producción de gran número de células

La fase gaseosa

• Los componentes más significativos de la fase gaseosa son:

• • Oxígeno: Las necesidades de oxígeno para la mayor parte de los cultivos celulares es cubierta con la tensión atmosférica, aunque existen cultivos, especialmente los cultivos de órganos que requieren una tensión de oxígeno superior (del 95%) posiblemente debido a la geometría del órgano y a las dificultades de difusión del gas en su interior.
  • Dióxido de carbono: El dióxido de carbono juega un complejo papel en el medio debido a que influye la cantidad de CO2 disuelto, el pH y la cantidad de iones HCO3-. Cada medio tiene una concentración recomendada de bicarbonato y tensión de CO2 para alcanzar el pH correcto.

n H2O + CO2 <=> H2CO3 <=> H+ + HCO3- (1)

n NaHCO3 <=> Na+ + HCO3- (2)

La fase liquida: medio de cultivo

Propiedades físicas

• pH y capacidad tamponadora
  • El pH óptimo de crecimiento para la mayoría de tipos celulares es de 7.4.
  • El medio de cultivo debe estar tamponado, a fin de evitar los cambios bruscos de pH.
  • El indicador de pH que se suele emplear es rojo fenol, que presenta

• • • color rojo a pH 7.4
    • naranja a pH 7.0
    • amarillo a pH 6.5
    • azul-rojo a pH 7.6
    • y púrpura a pH 7.8

• • La solución tamponadora más empleada es el tampón bicarbonato, que equilibra el CO2 atmosférico, a pesar de su escasa capacidad tamponadora, debido a su bajo coste, baja toxicidad, y beneficios nutricionales para el cultivo.
  • HEPES es la solución tamponadora de elección para células de crecimiento rápìdo por su elevada capacidad tamponadora en el rango 7.2 a 7.6, y se emplea en concentraciones de 10 a 20 mM.

• Osmolaridad

• • Muchas células en cultivo tienen una amplia tolerancia frente a la osmolaridad del medio, creciendo bien en el rango de 260 a 320 mOsm/kg, con pequeñas variaciones dependiendo de la especie considerada.
  • Es recomendable emplear medios ligeramente hipotónicos para compensar la evaporación durante el periodo de incubación, especialmente en incubadores sin control de la humedad ambiente.
  • Hay que tener en cuenta que la adición de HEPES, de drogas disueltas en ácidos fuertes y la neutralización posterior pueden afectar fuertemente a la osmolaridad del medio.

• Tensión superficial:
  • Se ha de mantener baja, y en general sólo se ve alterada por la aparición de espumas en los cultivos en suspensión donde se burbujea CO2.
  • La espuma produce un aumento de la desnaturalización de proteínas y se incrementa el riesgo de contaminación si la espuma alcanza el cuello del recipiente de cultivo.
  • Emplear un agente antiespumante de silicona.

• Temperatura
  • La temperatura debe estar bien controlada porque tiene gran influencia en la tasa de crecimiento de las células.
  • Influye en el pH del medio, por lo que se recomienda ajustar el pH del medio 0.2 unidades por debajo del óptimo, a temperatura ambiente, o bien preparar el medio completo, incluso suero, dejar equilibrar o/n en la estufa y después ajustar el pH, antes de añadirlo al cultivo.

• Viscosidad
  • La viscosidad del medio viene determinada fundamentalmente por el contenido en suero y tiene poca influencia sobre el crecimiento.
  • Sí es importante para evitar el daño celular en la agitación del cultivo (menor daño a más viscosidad) y en la tripsinización.
  • Se puede incrementar la viscosidad, especialmente en medios libres de suero, añadiendo al medio carboxi-metil-celulosa o polivinilpirrolidona.

• Condiciones fisiológicas
  • Hacen referencia a la composición del medio.
  • La principal dificultad para el establecimiento de las líneas celulares es el de obtener medios nutritivos adecuados que sean capaces de reemplazar al medio «natural» como extractos embrionarios, hidrolizados de proteína o sueros.
  • La aproximación recomendada para establecer un medio definido es empezar con un medio rico, por ejemplo Ham F12, suplementado con elevada concentración de suero (20 %) y probar suplementos que permitan reducir la cantidad de suero hasta poderla reducir o suprimir.
  • Después de años de investigación en la composición de los medios la elección de éstos sigue siendo empírica.

Componentes del medio de cultivo

• Soluciones salinas equilibradas
  • Una solución salina equilibrada es una mezcla de sales inorgánicas, incluyendo usualmente bicarbonato sódico, y suplementada con glucosa.
  • Se usan para diluir medios más completos, como medio de disección o lavado, o para incubaciones cortas que requieren un medio isotónico no completo nutricionalmente.

• Aminoácidos
  • Es necesario suplementar el medio basal con los aminoácidos esenciales.
  • Un suplemento común es el de glutamina, a 2 mM final, aunque hay algunas líneas celulares pueden usar el glutamato.
  • La glutamina es inestable en el medio, y se recomienda añadirla a partir de un stock concentrado (100x) que se mantiene congelado, no más de 1 semana antes de añadir el medio al cultivo (conservando a 4 C).

• Glucosa
  • Es la fuente de energía en muchos medios.
  • Metabolizada preferentemente via glucólisis hacia piruvato que puede ser convertido en lactato o acetoacetato que entra el ciclo de Krebs, y genera CO2.

• Vitaminas
  • En medios bien definidos se suplementan todas las vitaminas.
  • La limitación de vitaminas se manifiesta en la supervivencia de las células y en la reducción de la tasa de crecimiento más que en la densidad celular.

• Antibióticos y antifúngicos
  • A fin de evitar el crecimiento de contaminantes en el cultivo se suele suplementar éste con sustancias antibióticas de diferente espectro de acción.
  • La adición de antibióticos ha de ser estrictamente controlada para evitar efectos nocivos sobre el cultivo.
  • Es importante tener especial cuidado cuando se combinan dos o más antibióticos.
  • Mezclas de antibióticos de uso más común:
    • Penicilina (100 U/ml) / Streptomicina (100 ugr/ml). Combinación anti-microbiana.
    • Penicilina (100 U/ml) / Streptomicina (100 ugr/ml) / Fungizona (Wittaker). Combinación anti-microbiana y anti-fúngica.
    • Gentamicina (50 ugr/ml). Anti-microbiana, conviene ir alternándola con la penicilina-streptomicina.
    • Amphotericina-B (2.5 ugr/ml). Antifúngico y antilevaduras. Se han observado algunos efectos secundarios sobre el crecimiento de células de médula ósea humana en cultivo.

• Suero
  • Aporta hormonas y factores de crecimiento.
  • Los tipos de suero empleados son:
    • suero de ternera («calf serum», CF)
    • suero bovino fetal («fetal calf serum», FCS)
    • suero de caballo («horse serum», HS)
    • y suero humano («human serum», HuS).
  • El más usado es el suero de ternera, mientras que el suero bovino fetal es usado en líneas más exigentes, y el suero humano en líneas humanas.
  • Problemas de la utilización del suero
    • Existen gran cantidad de componentes presentes en cantidades variables en éste que pueden influir notablemente en el cultivo (hormonas, factores de crecimiento…).

• El suero varía de lote a lote:
  • Cada lote se puede emplear como máximo 1 año, probablemente deteriorándose a lo largo de ese tiempo, a pesar del almacenamiento a baja temperatura.
  • Cada cambio de lote de suero requiere realizar una serie de controles tediosos y costosos.
  • Si se cultivan varios tipos celulares cada uno puede requerir un lote diferente, lo que complica el almacenamiento e incrementa los costes.
  • Crea una dependencia importante de un suministro que no siempre puede mantenerse con la periodicidad y calidad requerida.

• • Si se han de purificar productos del medio de cultivo la presencia de los componentes del suero dificulta notablemente estos procesos.
  • El suero puede estar contaminado por virus y micoplasmas, lo que representa un grave peligro para el cultivo.
  • Algunos factores séricos como el factor de crecimiento plaquetario (PDGF) estimula la proliferación de fibroblastos, lo que puede ser un problema en el establecimiento de cultivos primarios especializados.
  • En conjunto supone un gran inconveniente para la estandarización de protocolos experimentales y de producción.

• Moléculas del suero que interfiere en los cultivos

• • Factores de adhesión como la fibronectina. Células crecidas en medios libres de suero requieren el suplemento de fibronectina (25-50 ugr/ml) o laminina (1-5 ugr/ml) en el medio.
  • Inhibidores de proteasas. Despues de la tripsinización de un cultivo el exceso de actividad tríptica se inhibe por la adición de suero al medio. En ausencia de éste deben usarse inhibidores de proteasas como el inhibidor de tripsina de soja.
  • Hormonas. El complemento hormonal dependerá especialmente del tipo celular, tales como hormona de crecimiento, T3, hidrocortisona, dexametasona, FSH.
  • Factores de crecimiento peptídico. En la actualidad se han identificado algunos polipéptidos de actividad mitogénica : FGF, EGF, PDGF y MSA, y con un rango amplio de actividad.
  • Nutrientes : Fe, Cu, Se, . y otros minerales, a pesar de que los fundamentos de su función son desconocidos en muchos casos.
  • Proteínas y poliaminas. La inclusión de albúmina bovina añade indefinición al medio, por ello se recomiendoa el uso de BSA libre de ácidos grasos (sualmente a 1-10 mgr/ml). Transferrina (10 ngr/ml) se requiere como portador de Fe, y se cree que puede tener actividad mitogénica. Putrescina se usa a alrededor de 100 nM.
  • A fin de reemplazar el suero se han desarrollado una serie de sustitutos comerciales como son SerXtend (NEN), Ventrex (Ventrex Lab Ltd.), Nu-serum (Collaborative Res.).