1. Maduración de los linfocitos B.
1.1. ONTOGENIA DE LAS CÉLULAS B.
La ontogenia de las células B es el proceso de desarrollo que conduce desde los primeros precurores reconocibles de linaje de B hasta las células plasmáticas secretoras de anticuerpos.
1.1.1. LOCALIZACIÓN.
En los mamíferos, primero se forman en el hígado fetal, a partir de la octava y novena semana de gestación (en los espacios Disse); posteriormente se desvanece esta función y pasa a la médula ósea (situación adyacente al endostio). Los linfocitos B son generados por el organismo a lo largo de la vida, aunque cada vez en cantidades menores. Esto también ocurre para otros linajes hematopoyéticos.
Los progenitores de los LB, en el estadio de reordenamiento de genes, pueden producir hasta 64 descendientes. Estas células migran al centro de la cavidad del hueso esponjoso, alcanzan la luz del sinusoide, y maduran en asociación con las células reticulares del estroma. Sólo llegan al final del proceso de maduración el 25% de los LB, y el resto muere por apoptosis, y son fagocitadas por los macrófagos.
1.1.2. FASES DEL PROCESO.
La ontogenia de las células B se puede dividir en dos grandes fases:
– Fase independiente de antígeno: ocurre en la médula ósea (órgano linfoide central o primario) y concluye con la salida de la médula del linfocito B maduro virgen e inmunocompetente.
– Fase dependiente de antígeno: ocurre en los órganos linfoides secundarios o periféricos, y que conduce a la diferenciación del linfocito B en dos subclones hermanos: uno de células plasmáticas secretoras de Ac y otro de linfocitos B cebados de memoria.
1.1.2.1. FASE INDEPENDIENTE DE ANTÍGENO
En cavidades del hueso esponjoso ocurre la linfopoyesis de células B. La maduración tiene lugar en sentido radial, desde el endostio hacia el seno venoso central. Los progenitores linfoides adyacentes al endostio van produciendo reordenaciones génicas y dividiéndose, de modo que cada progenitor genera unos 64 descendientes.
Estos descendientes, que ya son del estadio de células pre-B, emigran hacia el centro de la cavidad; la mayoría mueren por apoptosis (siendo fagocitados sus restos por macrófagos especializados llamados macrófagos de cuerpos tingibles). Finalmente, las células B maduras salen al seno venoso central.
Durante todo este proceso se dan interacciones estrechas entre células estromales y las distintas fases madurativas del linaje de células B. Cerca del endostio predominan las células estromales reticulares, mientras que cerca de los senos venosos se reconocen las células estromales adventicias, que son importantes en el mecanismo de tránsito de la célula B madura a dicho seno.
Las células pro-B se multiplican e interaccionan con las células estromales reticulares; esta interacción hace que la célula pro-B se diferencie a célula pre-B.
Las células stem de la médula ósea no tienen Ig en superficie, no han reordenados sus genes aún, y para diferenciarse requieren de la participación de células del estroma de la médula ósea (adiposctos, fibroblastos, reticulocitos, endoteliocitos, etc…) que participan en el proceso a 2 niveles: mediante contactos directos y mediante factores solubles. El proceso de diferenciación se inicia por la interacción del CD44 de la célula stem con ácido hialurónico de células del estroma. Esta interacción parece favorecer contactos entre el c-kit de la célula precursora con SCF (stem cell factor) de la célula del estroma o soluble. Así, la célula pro-B temprana se diferencia en célula pro-B tardía. La interacción c-kit-SCF favorece la proliferación de estos precursores.
Posteriormente, en las células pro-B tardías y células pre-B es necesaria la participación de factores solubles de activación y en concreto de la IL-7. Esta citosina, producida por las células del estroma, induce proliferación de los precursores. En las últimas etapas de diferenciación, los contactos entre los precursores B (células pre-B y B inmaduras) con las células estromales parecen estar mediados por moléculas de adhesión.
– Durante las fases de progenitor linfoide, pro-B y parte de pre-B se expresan los genes de activación de recombinación (RAG-1 y RAG-2), así como el gen de la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT).
– Durante las fases de progenitor y pro-B se reordena DH/JH en ambos cromosomas.
– En fase pre-B se intentan reordenaciones productivas VH/DHJH (Si no son productivas, la célula entra en apoptosis; si alguna de las dos es productiva, la célula escapa de la apoptosis, probablemente por la acción «de rescate» de la célula estromal). Simultáneamente está ocurriendo la adición de N-nucleótidos.
En esta fase pre-B tiene lugar la síntesis del receptor de células pre-B:
– Se ensambla VHDHJH con el gen C-mu, con lo que se producen cadenas pesadas de tipo mu.
– Se unen por splicing dos segmentos nuevos: VpreB y delta-5, que conduce a la síntesis de lo que se llama cadena L sustititutiva («pseudo-L»).
– El ensamblaje de dos cadenas mu y dos cadenas pseudo-L produce la pseudo-IgM de membrana (que va acompañada de Ig-alfa/Ig-beta), que es el receptor característico de células pre-B.
Este receptor de pre-B está implicado en algunos de los fenómenos que vienen a continuación:
– la cadena pesada mu H logra la exclusión alélica.
– El receptor en su conjunto induce la expansión proliferativa de las células pre-B que han logrado la reordenación productiva de la cadena H (se trata pues, de una selección positiva por el receptor de las propias células pre-B).
– En las células pre-B seleccionadas tiene lugar la reordenación aleatoria de genes de las cadenas ligeras (kappa primero y luego lambda). Si tiene éxito con el primer alelo kappa (productiva), se provoca la exclusión alélica del otro alelo de kappa y de los dos alelos de lambda. Si el primer alelo de kappa no es productivo, se intenta con el segundo, y si tampoco es productivo, se intenta con los dos alelos lambda. Si finalmente ninguno de los alelos es productivo, se entra en apoptosis.
Si la célula ha logrado reordenaciones productivas y ha escapado a la apoptosis, ha alcanzado la fase de célula B inmadura, que expresa en su superficie auténtica mIgM, con una determinada especificidad. Estas B inmaduras son de vida corta (3-4 días), y durante este período se produce el proceso de selección negativa: una parte de los linfocitos poseen mIg con especificidades autorreactivas, es decir, que reconocen moléculas del propio organismo (auto-antígenos). En respuesta al auto-antígeno la célula B inmadura hace un intento de «corregirse», induciendo una reordenación secundaria de genes de cadena L:
– La unión auto-antígeno vs. mIgM desencadena la detención de la diferenciación y al mismo tiempo mantiene o eleva los niveles de expresión de los genes RAG-1 y RAG-2, para «probar suerte» con otra reordenación de segmentos génicos de cadenas ligeras.
– Las células B inmaduras que hayan logrado reordenaciones que generen mIgM no auto-reactivas (bien sea en el primer intento o en esta fase de «corrección» de última hora) siguen adelante en su maduración.
– En cambio, las células B inmaduras que en esta segunda oportunidad que supone la corrección de cadenas L sigan siendo auto-reactivas, entran en apoptosis y mueren, o bien quedan anérgicas. Estamos, pues, ante un mecanismo para la evitación de clones de células B autoinmunes.
– Al madurar, los linfocitos B coexpresan mIgM + mIgD en sus superficies. Salen de la médula ósea a través del seno venoso (ayudados por las células adventicias del estroma) y emigran a los órganos linfoides secundarios (periféricos), donde aumentan el nivel de mIgD, de modo que éste llega a superar en 10 veces la cantidad de mIgM. Estos linfocitos B maduros vírgenes se pueden alojar temporalmente en dichos órganos, debido a que expresan receptores de alojamiento (homing) apropiados.
1.1.2.2. FASE DEPENDIENTE DE ANTÍGENO
En la periferia, el linfocito B virgen puede encontrarse o no con el antígeno para el que son específicas sus inmunoglobulinas de membrana.
1. Si no encuentra su antígeno específico, muere por apoptosis al cabo de unos pocos días o semanas (menos de un mes).
2. Si entra en contacto con su antígeno específico, se convierte en linfocito B activado que se expande clonalmente y se diferencia en dos subclones:
– Células plasmáticas secretoras de anticuerpos: El linfocito B pierde su mIgD y experimenta un cambio de clase por un mecanismo de splicing diferencial. Además, aumenta mucho la tasa de transcripción de los genes reordenados, por lo que se producen y secretan grandes cantidades de Ac con la misma especificidad que las mIg del linfocito B progenitor. Las células plasmáticas son células a término que ya no se diferencian más, y mueren por apoptosis al cabo de unos días.
– Células B cebadas de memoria: Las células B de memoria que quedan en los centros germinales de los órganos linfoides secundarios sufren hipermutación somática, por lo que va madurando la afinidad de sus mIg. Tienen vida larga (de meses a muchos años) que esta en función de su mIgD: las cadenas pesadas delta parecen regular la persistencia de células B maduras de memoria en la periferia.
1.2. DESARROLLO DE LA RESPUESTA DE Ac.
1.2.1. MADURACIÓN DE LA AFINIDAD.
El aumento de afinidad de los Ac T-dependientes se debe al cambio de IgM a IgG, puesto que no existe maduración de la afinidad en la IgM. La maduración de la afinidad se produce por HIPERMUTACIÓN SOMÁTICA en los genes recombinados de la región variable (CDR).
El grado de maduración depende de la dosis de Ag suministrada, porque cuando la [Ag] es baja, se va a producir una selección de los clones con Rc de superficie de mayor afinidad por el Ag, y estos van a producir Ac de mayor afinidad. Sí la dosis es alta, no hay esta selección, y la maduración y aumento de afinidad es menor.
En la maduración de la afinidad intervienen dos procesos:
a) Producción de clones de LB con mayor afinidad por ligeras modificaciones en las regiones CDR ocurridas tardíamente, en la respuesta primaria frente a un Ag T-dependientes.
b) Expansión selectiva de los clones de alta afinidad (LB memoria) provocada por el Ag.
1.2.2. MUTACIÓN Y PROGRESIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE.
La hipermutación somática es un hecho común en los LB de memoria cuando son activados durante la respuesta T-dependiente. Afecta selectivamente a los genes de las Ig y es importante en la producción de Ac de alta afinidad. Es un fenómeno normal y beneficioso, pero en ciertas ocasiones aparecen mutaciones que originan auto-Ac IgG de alta afinidad.
1.3. LOS MARCADORES DEL LINAJE B.
En el camino de la maduración, van encendiendo y apagando la expresión de ciertas proteínas de superficie (con diferente CD), que permiten determinar en que estado de diferenciación se encuentran las células.
Las células poco diferenciadas (pro-B) expresan el enzima Tdt. Los linfocitos B desde etapas de diferenciación tempranas expresan moléculas HLA de clase II que sólo existen además en células presentadoras de antígenos. También, en todas las etapas del proceso de diferenciación se expresa CD 19, que es el mejor marcador del linaje B.
En la tercera etapa madurativa (pre-B) se comienza a expresar la Inmunoglobulina en superficie, aunque sólo se completa en la ultima etapa de diferenciación (célula B inmadura), con la expresión de IgM e IgD en superficie. Es también en esta última etapa de diferenciación donde se aprecia la expresión de CD 20, que se pierde en el paso a células plasmáticas Los linfocitos B inmaduros y maduros expresan CD21 que es a la vez receptor para complemento y para el virus de Epstein-Barr (EBV). Las moléculas CD19 y CD20 son importantes en la proliferación y activación de los linfocitos B. Por último, en los linfocitos B activados se enciende la expresión de la proteína CD38 (marcador de estado de activación que también tienen los linfocitos T activados). Otra molécula accesoria fundamental en los linfocitos B es CD40, puesto que cuando esta molécula se une a su ligando, da señales al linfocito B para que cambie de isotipo en su Inmunoglobulina.
Otra forma de seguir la maduración de los linfocitos B es a traves de la expresión de los genes de la inmunglobulinas:
a) Las células primordiales linfoides expresan MHC-II y desoxinucleotidil-transferasa terminal (TdT). También son CD19+, CD24+.
b) Progenitor de células B (pro-B): comienza el reordenamiento de los genes de las cadenas pesadas de las Ig. Aparece CD10, CD20, CD21, CD22, CD38 y CD32.
c) Las células pre-B:
– Expresan cadenas mu (IgM) en el citoplasma. Aquí, ya se ha producido la exclusión alélica de los genes materno o paterno.
– Se produce el reordenamiento de los genes de las cadenas ligeras.
– Expresan cadenas mu en la membrana junto con los pseudogenes de las cadenas ligeras, en baja densidad.
– Pierden los marcadores TdT; CD38 y CD10.
d) Las células B inmaduras sintetizan cadenas ligeras kappa o lambda y pueden expresar IgM en la superficie. La célula B queda determinada a reconocer un tipo de Ag. Aparece CD23.
e) Los LB maduros son IgM+, IgD+ en superficie.
f) Células B activada/blástica: Son IgM+, IgD- en superficie.
g) Células de memoria: son IgM+, IgG+, IgA+ de membrana y no desarrollan aparato secretor.
h) Células plasmáticas: llevan Ig en el citoplasma y la secretan. El número de Ig de membrana disminuye o desaparece por completo. Aparece CD38 y PCA-1.
La célula B inmadura que sintetiza IgM de superficie, cuando es estimulada (no por el Ag), se divide, diferencia y sintetiza IgM (célula B inmadura), y después aparece la IgD (célula B madura). Hasta este punto, el proceso es independiente del Ag, pero el paso a célula plasmática sí es dependiente de Ag. La IgM/IgD/IgG o IgA de superficie tienen la misma especificidad por tener la misma región variable, aunque en la IgG e IgA puede surgir diversidad adicional en un clon (mutación somática).
Esta secuencia de aparición se cumple en las Ig séricas del feto y recién nacidos:
· IgM es la primera que se sintetiza.
· IgA es la segunda en sintetizarse.
· IgG comienza a sintetizarse unas semanas antes del parto y alcanza los niveles de adulto después de 1-2 años de vida, mientras que la IgA tarda más tiempo en alcanzar los valores normales. La IgG es la Ig con niveles más altos en el feto, pero procede de la madre por vía transplacentaria.
1.4. LINFOCITOS B CD5+.
Durante el desarrollo fetal, a la semana 17ª emigra a los ganglios linfáticos fetales una primera población de células B que son distintas a las estudiadas hasta ahora:
– Poseen mIgM, pero presentan el marcador de superficie CD5+, que comparten con timocitos y células T.
– Expresan inmunoglobulinas a partir de genes no mutados de línea germinal.
– Producen sobre todo IgM, pero también IgG e IgA, que se denominan «anticuerpos naturales». Dichos anticuerpos son de baja avidez, pero curiosamente son polirreactivos, y responden bien a los antígenos timo-independientes (no requieren colaboración de linfocitos T coadyuvantes, TH).
– Se ha propuesto que sus posibles funciones podrían ser el representar una primera línea de defensa contra ciertos microorganismos, el de eliminación de auto-componentes dañados y la participación en las redes idiotípicas.
– El equivalente en ratón de estas células se denomina Ly-1+
– < 12% en sangre periférica del adulto, pero en bazo, órganos linfoides embrionarios y sangre de cordón umbilical, son más del 50% de los LB.
– Son Ac polirreactivos que pueden ir dirigidos contra auto-Ag: DNA, Fc de Ig, proteínas del citoesqueleto, tiroglobulina, insulina, etc. Están en alta concentración en el adulto y son característicos de enfermedades autoinmunes: artritis reumatoides, enfermedad de Graves-Basedow, diabetes mellitus tipo I.
– Aumentado en leucemia linfática crónica.
1.5. LOCALIZACIÓN FINAL DE LOS LINFOCITOS B.
a) Con respecto al resto de linfocitos:
– Bazo (folículos primarios y secundarios de la pulpa blanca de la zona marginal): 50%.
– Ganglios linfáticos (zona cortical).
– Médula ósea: 75%.
– Sangre periférica: 10-15%.
Las células plasmáticas son poco frecuentes en sangre periférica (<0.1% de los linfocitos circulantes). Normalmente están en órganos linfoides secundarios (pulpa roja del bazo y médula de los ganglios) y en médula ósea.
b) Con respecto a los LB (% de LB repartido por órganos):
– Bazo: 27%.
– Ganglios linfáticos: 23%.
– Sangre periférica: 20%.
– Conducto torácico: 18%.
– Médula ósea: 6%.
– Amígdalas: 6%.
– Timo. ¿1-2%?.