A. CULTIVO, CONTEO, CUERPOS DE INCLUSIÓN, DAÑO CROMOSÓMICO.
1. CULTIVO DE VIRUS.
Durante los primeros años de investigación sobre virus, el empleo de animales era indispensable para el reconocimiento de estos agentes y a menudo era difícil el trabajo rápido y cuantitativo (hoy sólo se usa para el aislamiento primario de ciertos virus y para el estudio de la patogénesis y oncogénesis viral). Actualmente se puede hacer crecer a muchos virus en embriones de pollo o cultivo de tejidos (o células) en condiciones estrictamente controladas.
1.1. EMBRIÓN DE POLLO.
El crecimiento del virus en embrión de pollo puede dar lugar a la muerte del embrión, a la producción de vesículas o placas sobre la membrana carioalantoidea (virus herpes, viruela, vacuna), a la producción de hemaglutinina (influenza) o simplemente desarrollo de virus infectante (poliovirus tipo 2).
1.2. CULTIVO DE TEJIDOS.
El tipo de cultivo celular usado (primario, secundario ó línea celular) para el cultivo viral depende de la sensibilidad de las células a dicho virus en particular. En el laboratorio, la multiplicación del virus puede seguirse determinando lo siguiente:
a) Efecto citopático, o necrosis de las células en el cultivo de tejidos (poliomielitis, herpes, sarampión, adenovirus, CMV).
b) La inhibición del metabolismo celular o incapacidad de las células infectadas por el virus para producir ácido (enterovirus).
c) La aparición de una hemaglutinina (parotiditis, influenza) o un antígeno fijador del complemento (poliomielitis, varicela, sarampión).
d) La adsorción de eritrocitos de las células infectadas llamada hemadsorción (parainfluenza, influenza). Esta reacción se hace positiva antes que los cambios citopatogénicos se hagan visibles.
e) Interferencia por el virus no citopatógeno (rubéola) con replicación y efecto citopático de un segundo virus indicador (echovirus).
f) Transformación morfológica por un virus oncogénico, seguido por lo general de la perdida del contacto por inhibición y el agrupamiento de células en los focos discretos. Tales alteraciones constituyen una propiedad heredable de las células.
B. CONTEO DE VIRUS.
1. MÉTODOS FÍSICOS.
1.1. MICROSCOPIO ELECTRÓNICO.
Las partículas virales pueden ser contadas directamente en el microscopio electrónico mediante la comparación con una suspensión estándar de partículas de látex de tamaño semejante. Sin embargo, una preparación relativamente concentrada de partículas virales es necesaria para este procedimiento, y las partículas virales infectantes no pueden ser distinguidas de las no infectantes.
1.2. HEMAGLUTINACIÓN.
La hemaglutinación por virus ha conducido a métodos de conteo rápidos y baratos para el análisis viral. Ya que los virus no infectantes dan la reacción positiva, la prueba mide el total de las partículas virales presentes.
Los virus que dan esta reacción positiva son los ortomixovirus, paramixovirus, poxvirus, arbovirus y otros.
2. MÉTODOS BIOLÓGICOS.
Los análisis cuánticos dependen de la medición de la muerte del animal, de la infección del animal o de los efectos citopáticos en el cultivo de tejido sobre el punto de viraje de la dilución del virus a prueba. El título se expresa como 50% de la dosis infectante (DI50), que es el recíproco de la dilución de virus que produce el efecto en el 50% de las células o de los animales inoculados. Los análisis precisos requieren un gran número de sujetos en la prueba.
Los análisis de pústulas producidas sobre la membrana carioalantoidea de los huevos embrionados, inoculados con diluciones de virus, pueden ser usados para determinar la cantidad de virus infectantes (herpes, viruela).
El análisis de placa es el más ampliamente usado para determinar los virus infectantes. Se inoculan cepas individuales de células huésped con diluciones adecuadas de virus y, después de la adsorción , son recubiertas con medio que contiene agar o carboximetil celulosa para prevenir la diseminación viral. Después de varios días, las células inicialmente infectadas han producido virus que diseminan sólo a las células circunvecinas, produciendo una pequeña zona de lesión o placa. Bajo condiciones controladas, una placa sólo puede originarse de una sola partícula viral infectante, denominándose unidad formadora de placa (UFP). El efecto citopático de las células infectadas en el interior de la placa puede ser distinguido de las células no infectadas con o sin tinción adecuada.
C. FORMACIÓN DE CUERPOS DE INCLUSIÓN.
Durante la multiplicación de los virus en el interior de las células pueden producirse estructuras anormales específicas, denominadas cuerpos de inclusión. Estas estructuras llegan a ser mucho más grandes que las unidades individuales de virus, y a menudo muestran afinidad para los colorantes ácidos (eosina). Pueden estar situados en el núcleo (herpesvirus), en el citoplasma (poxvirus) o en ambos (sarampión).
La presencia de cuerpos de inclusión puede ser de considerable utilidad en el diagnóstico. Las inclusiones intracitoplasmáticas de las células nerviosas (cuerpos de Negri) son patognomónicas de la rabia.
D. DAÑO CROMOSÓMICO.
Una de las consecuencias de la infección de las células por virus es la alteración del cariotipo. La mayoría de los cambios observados se producen al azar. Frecuentemente ocurre rompimiento, fragmentación, rearreglo de los cromosomas, cromosomas anormales, y cambio en el número de cromosomas.
TÉCNICA DE AISLAMIENTO DE VIRUS
A. MUESTRAS PARA EL ESTUDIO.
Tabla: relación entre la fase de la enfermedad y la presencia de virus en productos patológicos y la aparición de anticuerpos específicos.
| Etapa o período de la enfermedad | Virus demostrable en productos patológicos | Ac específicos demostrables |
| Incubación | Raramente | No |
| Prodrómico | Ocasionalmente | No |
| Iniciación | Frecuentemente | Ocasionalmente |
| Aguda | Frecuentemente | Frecuentemente |
| Recuperación | Raramente | Generalmente |
| Convalecencia | Muy raramente | Generalmente |
Tabla: muestras para el aislamiento de los virus
| MANIFESTACIONES CLÍNICAS Y AGENTES CAUSATIVOS COMUNES | MUESTRA CLÍNICA | NECROPSIA O BIOPSIA |
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Infecciones de las vías respiratorias altas Rinovirus Parainfluenza Respiratorios sincitiales Adenovirus Enterovirus Reovirus |
Raspado faríngeo o secreciones nasales Raspado faríngeo y heces |
… … |
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Infecciones de las vías respiratorias inferiores Influenza Adenovirus Parainfluenza Rinovirus Respiratorios sincitiales |
Raspado faríngeo y heces | Pulmón |
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Pleurodinia Coxsackievirus |
Raspado faríngeo y heces | … |
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Enfermedades de la piel y mucosas Vesiculares Viruela y vacuna Herpes simple Varicela-zoster Enterovirus Exantemáticas Sarampión Rubéola Enterovirus |
Líquido de las vesículas Líquido de las vesículas, raspado faríngeo y heces Raspado faríngeo y sangre Raspado faríngeo y heces |
Hígado, bazo, pulmón … … … |
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Diarrea de los lactantes Rotavirus |
Heces | Pared intestinal, biopsia |
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Infecciones del SNC Enterovirus Herpes simple Parotiditis Cariomeningitis linfocitaria Arbovirus Sarampión Papovirus humano |
Heces y LCR. Raspado faríngeo y LCR Raspado. faríngeo, LCR y orina. Sangre y LCR Sangre y LCR … … |
Tejido encefálico |
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Parotiditis Parotiditis (paperas) Citomegalovirus (CMV) |
Raspado faríngeo (conducto de Stensen) y orina | … |
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Enfermedades febriles graves Fiebre por garrapatas del Colorado Fiebre amarilla Dengue |
Sangre | … |
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Anomalías congénitas CMV Rubéola |
Orina y raspado faríngeo Raspado faríngeo y LCR |
Riñón, pulmón Ganglios linfáticos, pulmón, bazo. |
B. PRESERVACIÓN DE LOS VIRUS.
1. CONGELACIÓN. En nieve carbónica o en congeladores especiales que alcanzan -70ºC se puede conservar el virus por un tiempo menor de un año. En nitrógeno líquido (-150ºC) puede conservarse más de un año.
2. LIOFILIZACIÓN. La adición de 10-50% de plasma normal o suero a la solución que contiene virus impide que este se congele y se seque. Si se emplea plasma o virus es importante que contenga anticuerpos neutralizantes. La leche desnatada es otro medio protector en el cual se puede suspender otro medio que contenga virus.
C. PREPARACIÓN DE INÓCULOS. Los materiales líquidos libres de bacterias como sangre total, plasma o LCR pueden inocularse en cultivos celulares, en animales, en embriones de pollo o cultivos de tejidos, directamente o diluidos en solución amortiguadora de fosfatos (pH 7.6).
Si el material con que se va a trabajar contiene bacterias (lavados de gargantas, heces, tejido infectado o insectos), deben inactivarse o eliminarse antes de su inoculación.
a) Agentes bactericidas:
– Antibióticos en combinación con centrifugación diferencial.
– Éter al 10-15% si no es perjudicial para el virus.
b) Métodos mecánicos:
– Filtros de cerámica, porcelana y asbestos. Se usan poco por la perdida de virus por adsorción.
– Centrifugación diferencial. Se sedimentan a las bacterias a bajas velocidades para que no sedimenten los virus. Después se centrifuga el virus a alta velocidad y en el sedimento está el virus.
D. INOCULACIÓN EN ANIMALES. Los animales de laboratorio empleados para el aislamiento de virus incluyen al ratón, criceto (hámster), rata blanca, cobayo, conejo y mono. Para determinados virus se emplean ratones lactantes (con menos de 48 horas).
E. DESARROLLO EN CULTIVOS CELULARES. Las técnicas de cultivo celular son las más usadas para el aislamiento de virus provenientes de muestras clínicas. Cuando los virus se multipliquen en un cultivo de tejido, producen efectos biológicos (cambios citopáticos, interferencia viral, etc) que permiten la identificación del agente.
Los cultivos celulares contienen a las células en suspensión en medio nutritivo que contiene soluciones salinas y diversos factores de crecimiento (usualmente glucosa, vitaminas y aminoácidos). El medio de cultivo se complementa con antibiótico y bicarbonato.
Con muchos virus, el crecimiento del agente marcha paralelamente a la degeneración de tales células. Algunos virus producen efectos citopáticos característicos (formación de sincitios, interferencia vírica, cambios de forma celular, etc.) en el cultivo de tejidos, haciendo posible el establecimiento de un diagnóstico presuntivo rápido, cuando se conoce el síndrome clínico.
La identidad del virus se establece con antisueros específicos de tipo, los cuales inhiben el desarrollo viral o reaccionan con los antígenos virales en las pruebas de fijación del complemento, ELISA, contrainmunoforesis, inhibición de la hemaglutinación.
F. HUEVOS CON EMBRIÓN. Los huevos de embrión pueden ser inoculados por varias vías. Después de la inoculación, los huevos se reincuban durante varios días a 36-38ºC y se examinan diariamente.
DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y LOCALIZACIÓN INMUNITARIA DE LAS INFECCIONES VIRALES
A. PRUEBAS DE NEUTRALIZACIÓN.
Los Ac neutralizadores de virus se miden mediante la adición de suero que contiene estos Ac a una suspensión de virus y luego inoculando la mezcla en cultivos de células susceptibles. La presencia de Ac neutralizadores se demuestra si no hay efecto citopático (ECP), mientras que los cultivos celulares de control que habían recibido virus más un suero libre de Ac desarrollando ECP.
El virus en una mezcla neutralizada no se destruye. Cuando algunas mezclas de virus-anticuerpo son tratados con ácido (pH 2.0), el ácido desnaturaliza al Ac y libera al virus en su estado original, totalmente infectante.
El valor de estos Ac se puede determinar empleando una cantidad constante de virus y cantidades decreciente de suero; o el suero no diluido frente a concentraciones decrecientes de virus.
1. PRUEBAS DE NEUTRALIZACIÓN CUANTITATIVA.
Se inoculan ratones de susceptibilidad y edad estándar por la vía habitual con la mezcla de virus y suero. La observación se debe hacer diariamente buscando los signos de la enfermedad, para establecer las especificidades de la muerte. Las muertes que ocurren dentro de las primeras 24 horas después de la inoculación se consideran debido a causas traumáticas o en todo caso no debidas al virus.
Esta prueba también se puede hacer sobre células en cultivo colocadas en tubos de cultivo o en placa de cultivo. Se añade una concentración inicial de virus de 100 DICT50 a la mezcla virus-suero. El suero debe ser descomplementado durante 30 minutos a 56ºC para evitar la destrucción celular por el complemento. La presencia de replicación vírica se puede detectar por el efecto citopático del virus (por ejemplo, formación de sincitios) o detectando antígenos víricos en el sobrenadante de cultivo (ELISA).
2. TITULACIÓN DEL VIRUS.
Es necesario titular el virus cada vez que se haga una prueba de neutralización cuantitativa. Los puntos finales de 50% (50% dosis infectante de cultivo tisular, DCIT50; 50% de dosis infectante, DI50; o 50% de dosis letal, DL50) se calculan de acuerdo con el método de Reed-Muench o el de Kaerber.
3. ÍNDICE DE NEUTRALIZACIÓN.
El índice de neutralización es la expresión de la relación entre la DL50 de control de virus y la DL50 de las mezclas de suero-virus en las que el virus ha sido añadido sin diluir.
| índice de neutralización = – (Log DL50 testigo – Log DL50 mezcla) |
Se considera que un índice de neutralización menor de 10, indica la ausencia de Ac.
B. PRUEBAS DE FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO.
Los sueros antivirales fijan el complemento en presencia de sus antígenos homólogos. Actualmente la mayor parte de los antígenos se obtienen de cultivos celulares o del líquido alantoideo del embrión de pollo después de su infección.
Del suero inactivado (a 60ºC durante 20 minutos) se hacen diluciones al doble, comenzando por la de 1/2, y se colocan 0.25 ml de cada dilución en una serie de tubos de hemolisis. Se agregan entonces 0.25 ml de antígeno, más 2 unidades hemolíticas de complemento que estarán contenidas en 0.5 ml. La mezcla se incuba a 37ºC por una o dos horas, o para mayor sensibilidad a 2-4ºC durante 18 horas. Después de la incubación se añade el sistema hemolítico (0.25 ml de una suspensión al 3% de eritrocitos de carnero + 0.25 ml de suero antieritrocitario de carnero ,hemolisina, diluido de tal forma que contenga 3 dosis hemolíticas). Los tubos se incuban a 37ºC durante 20 minutos y se hace la lectura visualmente. La ausencia de hemolisis indica fijación del complemento.
C. ANÁLISIS DE LA HEMAGLUTINACIÓN POR INMUNOADHERENCIA (AHIA).
La AHIA es una prueba dependiente del complemento que es 10 a 100 veces más sensible que la prueba de fijación del complemento y fácilmente adaptable a determinaciones cuantitativas en un gran número de muestras, particularmente para medir anticuerpos virales después de la infección.
Los inmunocomplejos formados se incuban con una fuente de complemento fresco y a continuación se exponen a ditiotreitol (DTT), que estabiliza los inmunocomplejos que contienen fracciones del complemento (C2, C4, C3). Después de añadir los eritrocitos humanos del grupo O, se forma un complejo estable entre el C3 y los Rc de C3 que hay en la superficie de los eritrocitos y se produce la microtitulación. La prueba se hace en placas microtituladoras con fondo en U, de polivinilo.
D. PRUEBAS DE INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IH).
Muchos virus aglutinan a los eritrocitos y esta reacción puede ser inhibida específicamente por sueros inmunizantes de convalecientes. Veremos como ejemplo la prueba para el virus de la influenza.
1. ESTÁNDARES Y TITULACIÓN. Se usa una suspensión estándar de eritrocitos humanos del grupo O al 0.5%. El antígeno estándar es comercial y se distribuye liofilizado.
Los resultados de la aglutinación se registran basándose en el patrón de aglutinación:
a) La aglutinación positiva esta indicada por un revestimiento rojo, granular y difuso en el fondo de la pocillo de la placa.
b) La falta de aglutinación está indicada por la formación de un botón rojo compacto en el fondo del tubo, que se desliza cuando se inclina el tubo.
c) La aglutinación parcial está indicada por un aspecto intermedio entre revestimiento difuso del fondo del tubo y botón rojo. Este toma la forma de un anillo con el centro vacío.
2. PROCEDIMIENTO.
a) Se inactivan los sueros que van a probarse (53ºC durante 30 minutos) y después se diluyen a 1/8 con solución salina.
b) Se hace una dilución seriada del suero por triplicado en escala 1/8 a 1/4096.
c) Se agrega el hemaglutinante (4 unidades de hemaglutinina por tubo).
d) Se agita y se añade una suspensión de eritrocitos de carnero al 0.5%. Se agita y se incuba a temperatura ambiente durante 60 minutos.
e) Leer el título de cada suero. El titulo de un suero se define como la más alta dilución de suero que inhibe por completo la hemaglutinación.