2. REACCIONES DE HEMAGLUTINACIÓN Y LISIS.
2.1.2. AGLUTINACIÓN INDIRECTA.
2.1.2.1. AGLUTINACIÓN INDIRECTA EN PORTA.
2.1.2.2. HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA.
2.1.3. INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN.
2.2.1. REACCIONES PARA MEDIR EL COMPLEMENTO.
2.2.1.1. CAPACIDAD HEMOLÍTICA (CH50).
2.2.1.2. HEMOLISIS RADIAL SIMPLE.
2.2.1.3. OTROS MÉTODOS PARA MEDIR EL COMPLEMENTO.
2.2.1.4. REACCIONES QUE UTILIZAN EL COMPLEMENTO: REACCIÓN DE FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO (RFC).
2. REACCIONES DE HEMAGLUTINACIÓN Y LISIS.
2.1. AGLUTINACIÓN.
Son técnicas más sensibles que las anteriores que se usan para valorar la presencia de Ac específicos en el suero. Se basan en la capacidad de los Ag particulados, unidos a sus Ac complementarios, para aglutinarse dando lugar a un agregado que se ve a simple vista.
Esta técnica puede ser:
– Cualitativa: resultado positivo o negativo.
– Cuantitativo: sí se hace una dilución seriada del suero y se calcula el título de Ac. Título de Ac es la inversa de la máxima dilución del suero que da positiva la reacción de aglutinación.
Dependiendo de la conformación del Ag, se pueden distinguir dos tipos básicos de aglutinación:
2.1.1. AGLUTINACIÓN DIRECTA.
Se utilizan Ag formes o particulados en suspensión (bacterias protozoos o esporas). Todos ellos exhiben determinantes antigénicos o epitopos en su periferia.
Cuando esta suspensión antigénica se enfrenta a un suero problema:
– REACCIÓN POSITIVA: Los Ac frente a esos epitopos producirán la correspondiente aglutinación y formación de IC, evidenciándose mediante la aparición de un velo malla característico en el medio.
– REACCIÓN NEGATIVA: sí no hay Ac, no se formaran los IC y en consecuencia los Ag particulados sedimentan formándose un anillo o botón bien definido en el fondo del tubo o pocillo de reacción.
2.1.2. AGLUTINACIÓN INDIRECTA.
Para esta técnica se utilizan Ag particulado soluble sensibilizado (epitopos sobre un soporte sólido inerte en solución). Se usan bolas de látex, carbón activo, bentonita, etc.
2.1.2.1. AGLUTINACIÓN INDIRECTA EN PORTA.
Se suele efectuar sobre un porta y no en tubo o placa, mezclándose una gota de látex sensibilizado y una gota de suero, verificándose la reacción en un tiempo muy corto (2-10 minutos).
La reacción positiva se evidencia por la aparición de un moteado característico, ausente en la negativa. Normalmente la técnica es cualitativa, con resultado +/-; pero puede convertirse en cuantitativo, si la reacción se efectúa con diluciones seriadas.
2.1.2.2. HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA.
Cuando en lugar de partículas inertes se usan eritrocitos convenientemente tratados (hematies de carnero tanizados), como soporte de los Ag (hematies sensibilizados), se denomina HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA (HAI). Se efectúa en placa de microtitulación, con diluciones seriadas de los sueros y la lectura es similar a la de la aglutinación directa.
Esta prueba es un desarrollo directo de la prueba de Coombs que se usa para determinar Ac contra Ag de la superficie de los eritrocitos.
– PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA: detecta Ac contra el Ag Rh en la madre gestante.
– PRUEBA DE COOMBS DIRECTA: detecta la presencia de IC sobre la superficie de los eritrocitos del recién nacido.
2.1.3. INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN.
Una variante es la INHIBICIÓN DE LA HAMAGLUTINACIÓN (IHA), en la que los posibles Ac existentes en la muestra problema son neutralizados previamente, por lo que la lectura de resultados se interpreta en sentido contrario a la hemaglutinación:
– REACCIÓN POSITIVA: presencia de botón.
– REACCIÓN NEGATIVA: aparición de velo.
Esta técnica se usa para diagnosticar microorganismos que por sí solos son capaces de aglutinar glóbulos rojos, como el virus de la rubéola. Sí en el suero del enfermo hay Ac contra el virus de la rubéola, se produce un bloqueo de los virus y se inhibe la aglutinación. La ausencia de aglutinación se interpreta como POSITIVO, porque hay Ac contra el virus de la rubéola.
2.2. REACCIONES DE LISIS.
Las reacciones inmunológicas que utilizan el complemento se basan en su capacidad lítica. Esta capacidad lítica esta disminuida en enfermedades autoinmunes, deficiencias congénitas y enfermedades infecciosas.
La formación de IC conlleva en muchos casos la fijación de complemento. Esta fijación no es visible, pero puede revelarse al manifestarse alguna de las reacciones biológicas del complemento (hemolisis).
2.2.1. REACCIONES PARA MEDIR EL COMPLEMENTO.
2.2.1.1. CAPACIDAD HEMOLÍTICA (CH50).
Es la principal prueba en el screning de los déficits del complemento
Se determina la concentración de suero que es capaz de producir la lisis del 50% de un preparado estándar de eritrocitos sensibilizados con Ac antieritrocitos. La prueba se efectúa en tubos o placas, de acuerdo con la siguiente metodología:
a) Sensibilización de hematies de carnero, previamente lavados, por incubación con hemolisina de carnero (Ac antieritrocitos de carnero).
b) Preparación de los sueros: se disponen tubos con diferentes cantidades de suero, a los que se añade un volumen determinado de hematies de carnero sensibilizados. Como control se dispone un tubo de lisis total, que contiene sólo hematies sensibilizados y agua destilada. Después de la incubación se efectúa la lectura en el espectrofotómetro.
c) Interpretación de resultados:
– Cada lectura se divide por la correspondiente a la lisis total y se multiplica por 100.
– Se representa gráficamente los ml de suero (ordenadas) frente a los porcentajes calculados (abcisas) en un papel semilogarítmico.
– Se determina por extrapolación el valor correspondiente al 50%, que será la cantidad de suero necesaria para lograr una capacidad hemolítica 50.
2.2.1.2. HEMOLISIS RADIAL SIMPLE.
Es similar a la inmunodifusión radial simple, pero aquí se produce hemolisis (se forma un halo de hemolisis). Mide la actividad total de la vía clásica o CH100.
2.2.1.3. OTROS MÉTODOS PARA MEDIR EL COMPLEMENTO.
Se usan para medir los componentes individuales del complemento por separado:
– Nivel total: RIA, ELISA, nefelometría, turbidimetría.
– Nivel funcional: hemolisis de eritrocitos sensibilizados o reacción enzimática con un sustrato que genera calor.
2.2.1.4. REACCIONES QUE UTILIZAN EL COMPLEMENTO: REACCIÓN DE FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO (RFC).
– Esta prueba se usa para detectar Ac o Ag.
– El principio básico de una prueba de fijación de complemento es la activación y el consumo (fijación) del complemento en presencia de una reacción Ag:Ac específica.
– El sistema de detección usado es la lisis de GR en la presencia del antisuero específico para los GR (sistema hemolítico) si el complemento no se consume en la reacción Ag:Ac inicial.
– En la mayoría de las reacciones Ag-Ac, el complemento se une al complejo y es usado o fijado. Este proceso puede usarse para detectar cantidades muy pequeñas de Acs. La concentración que detecta es de mgr/ml.
– Su ejecución requiere de gran cuidado y buenos controles.
– Se hace en dos etapas: la fijación del C’ y el revelado de la reacción con el sistema hemolítico.
Las fases de la técnica:
a) Se añade una cantidad determinada del Ag específico de aquellos Ac que se pretende detectar. si hay Ac en el suero problema, se unirán a los Ag y se forman IC.
b) Se añade el complemento a la mezcla. Sí hay IC, éstos fijaran el complemento y se consumirá. En caso contrario, el complemento quedara libre.
c) Se añade el sistema revelador de la reacción o sistema indicador, constituido por una mezcla de células indicadoras (eritrocitos de carnero) y una cantidad de Ac subaglutinante (Ac antieritrocitos de carnero).
d) Lectura de la prueba:
– REACCIÓN POSITIVA: no hay hemolisis porque el complemento se consumió en la reacción inicial. Indica que hay Ac en el suero problema.
– REACCIÓN NEGATIVA: hay hemolisis porque el complemento no se consumió en la reacción inicial. Indica la ausencia de Ac en el suero problema.
La prueba suele efectuarse en placas de plástico y realizando un banco de dilución para hallar el título de Ac (ultimo pocillo en el que la reacción es positiva). Hay que realizar controles porque los IC y algunos Ag bacterianos pueden fijar el complemento.