3. REACCIONES INMUNOENZIMÁTICAS.
3.2. PASOS GENERALES DE UN ELISA
3.2.1. REACTIVOS QUE GENERAN COLOR.
3. REACCIONES INMUNOENZIMÁTICAS.
Revelan la presencia de Ag o Ac mediante una reacción Ag-Ac específica, en la que el complejo inmune formado se mide por una reacción colorimétrica catalizada por una enzima acoplada químicamente a uno de los reactivos, en presencia del sustrato adecuado.
El ELISA se basa en dos supuestos:
– El Ag o el Ac se pueden unir a un soporte en fase sólida reteniendo su actividad inmunológica.
– Tanto el Ag como el Ac pueden unirse a una enzima, y el conjugado mantiene tanto su actividad inmunológica como enzimática.
Los métodos inmunoenzimáticos (ELISA) se han desarrollado en tres direcciones:
– Localizar los constituyentes celulares.
– Medición de pequeñas cantidades de componentes en los líquidos biológicos.
– Detección de precipitados inmunes inmovilizados sobre papeles de nitrocelulosa.
3.1. ENZIMOINMUNOANÁLISIS
El ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) se basa en la reacción de un Ac o de un Ag acoplado de forma covalente a una enzima, con un Ag o un Ac inmovilizado (fijado sobre un soporte), para detectar finalmente la actividad enzimática con ayuda de sustratos específicos. Tipos de ELISAs:
A) HOMOGÉNEOS: son en medio líquido y no se requiere la separación de los reactivos . La reacción sigue la ley de acción de las masas.
A1) Ventajas:
Más precisos
En general automatizados, se llevan a cabo sin entrenamiento especial
A2) Desventajas:
Son más costosos en reactivos
En general sólo sirven para fármacos
B) HETEROGÉNEOS: se requiere separación entre el reactivo libre y el unido. Para ello, el Ag o el Ac están inmovilizados. El reactivo complementario difunde hacia él y se le une específicamente.
B1) Ventajas :
Menos interferencias, más específicos y sensibles
Instrumentación menos costosa
Admiten mayor tamaño de muestra, así disminuye el límite de detección.
Más versátiles en cuanto a tipo de analito
B2) Desventajas :
Más difíciles de automatizar
Mayor tiempo de análisis
Los métodos de ELISA HETEROGÉNEOS dependiendo de la actividad enzimática se dividen en dos tipos:
– – Competitivos: En este método, el anticuerpo de la muestra va a competir con el conjugado por un número limitado de sitios de unión del antígeno. Habrá ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.
– – No competitivos: Consiste en enfrentar la muestra con el antígeno o anticuerpo que está en la fase sólida. Si una muestra es positiva se formará el complejo antígeno-anticuerpo y al agregar el conjugado reaccionará con el respectivo sustrato desarrollando color.
Dentro de los no competitivos tenemos:
– – Los directos que detectan antígenos
– – Los indirectos que detectan anticuerpos.
3.2. PASOS GENERALES DE UN ELISA
1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo
2. Todas las placas son sometidas a un tapizado con gelatina o albúmina sérica bovina, que recubre las zonas en las que no se ha fijado el primer componente de la reacción (Ag o Ac).
3. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos
4. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno tapizado en el posillo.
5. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de anticuerpo o antígeno no unido
6. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima
7. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo
8. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida
9. Adición del sustrato
10. Unión del sustrato a la enzima
11. Generación de la señal. La última parte de un inmunoensayo en que la marca es enzimática es la cuantificación de la enzima. Métodos de detección:
a) Espectrofotométrico o colorimétrico. Se mide la aparición de un cromóforo.
b) Fluorométrico- Se mide la aparición de un producto fluorescente
c) Quimioluminiscente- Se mide la aparición de un producto luminiscente.
12. Lectura del color en un lector de placas.
13. Cuantificación en ELISA: curvas standard
3.2.1. REACTIVOS QUE GENERAN COLOR.
Los reactivos utilizados suelen ser los mismos (peroxidasa, fosfatasa alcalina, beta-glucosidasa, glucosa oxidasa) para todos los ELIASAs, con la diferencia del sustrato de la enzima utilizada:
d) Puede generar productos coloreados y solubles que se miden por espectrofotometría.
– En presencia de agua oxigenada, los cromógenos usados para la peroxidasa se reducen y dan productos solubles y coloreados. Los sustratos son la o-dianazina, o-fenilenodiamina (OPD), tetrametilbencidina (TMB), ácido- 2,2-acino-di-(3-etil)benzatiazolina-6- sulfónico (ABTS).
– Cuando queremos un precipitado, se usa para revelar la reacción a la peroxidasa y diaminobenzidina, que generan un precipitado de color café.
– La glucosa oxidasa reacciona con la glucosa y libera agua oxigenada que se detecta por una mezcla de peroxidasa y un cromógeno. Sí queremos un precipitado, podemos usar una sal de tetrazolio.
– La fosfatasa alcalina y la beta-glucosidasa utilizan como sustrato a el paranitrofenilfosfato y el ortonitrofenil-beta–D-galactopiranosido, los cuales son hidrolizados por la enzima y se libera el nitrofenol soluble.
– Puede generar precipitados coloreados insolubles y estables en el mismo lugar de la enzima (ELISA-DOT y Western-blot sobre papel de nitrocelulosa) y localizar constituyentes celulares (inmunohitoquímica).
3.3. TIPOS DE ELISAs
3.3.1. ELISA DIRECTO
Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina, …) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado, o bien se le ha añadido).
Consta de las siguientes etapas:
• Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de antígenos específicos. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición de anticuerpos marcados (“conjugados”) con una enzima; si los anticuerpos reaccionan con los antígenos, el complejo quedará solubilizado. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
3.3.2. ELISA INDIRECTO
Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos : uno primario contra el antígeno, y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señál debida a la unión de dos o más anticuerpo secunadarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran cantidad de antígenos.
Consta de las siguientes etapas:
• Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
3.3.3. ELISA SANDWICH
Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
A) ELISA Sándwich “DAS” (Double Antibody Sandwich).
Consta de las siguientes etapas:
• Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno), reaccionará específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados.
• Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
B) ELISA Sándwich “HADAS”.
Consta de las siguientes etapas:
• Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno), reaccionará específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados.
• Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte), los cuales reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionado.
• Adición de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
