Publicado en: García-Álvarez M, Berenguer J, Guzmán-Fulgencio M, Álvarez E, Cosín J, Micheloud D, Jiménez-Sousa MA, Fernández-Rodríguez A, Aldámiz-Echevarría T, Carrero A, Miralles P, Resino S (*). Bacterial DNA translocation and liver disease severity among HIV infected patients with chronic hepatitis C. J Acquir Immune Defic Syndr 2012; 61 (5): 552-556. (A; FI= 4.65).
INTRODUCCIÓN
En la era de la terapia antirretroviral combinada (cART), la hepatitis C crónica es la principal causa de muerte entre las personas infectadas por el VIH [1]. Los pacientes coinfectados se caracterizan por una mayor tasa de progresión de la fibrosis, cirrosis y enfermedad hepática terminal que los pacientes monoinfectados con VHC [2]. Sin embargo, los mecanismos por los que la infección por el VIH acelera la progresión de la hepatitis C crónica son aún desconocidos.
La translocación bacteriana (TB) es un mecanismo a través del cual el alcohol y algunas condiciones entéricas pueden causar enfermedad del hígado [3, 4]. La depleción de los linfocitos CD4+ de la mucosa asociada a la infección por VIH se ha relacionado con la interrupción de la integridad epitelial del intestino y aumento de la translocación a través de la mucosa de bacterias y productos bacterianos (ADN bacteriano y endotoxinas) desde la luz intestinal a la circulación sistémica [5, 6]. El lipopolisacárido (LPS) es un componente de la pared celular de las bacterias gram-negativas, y por lo tanto sólo está presente en una proporción de la microbiota bacteriana entérica. Otros marcadores diferentes al LPS y de espectro más amplio han sido evaluados, tales como los niveles plasmáticos de secuencias de ADN, que codifica la subunidad bien conservada de ARNr 16S (16S ADN ribosomal), común a la mayoría de las bacterias [7]. La detección de este ADN bacteriano (bactDNA) en el plasma es probablemente un mejor método para medir la TB [8], y se ha propuesto como un factor independiente de mal pronóstico en los pacientes no infectados con cirrosis [9].
La TB derivada del daño intestinal es una de las causas de la activación inmune sistémica en la infección crónica por VIH [6, 10], que puede jugar un papel crucial en el curso acelerado de daño hepático en pacientes coinfectados VIH/VHC [11, 12]. Además, los macrófagos hepáticos o células de Kupffer son responsables de la limpieza de productos de TB, sin embargo, estas células pueden ser infectadas por el VIH, lo que podría resultar en la alteración de la capacidad para limpiar estos productos TB potencialmente fibrogénicos [13]. Sin embargo, hoy en día, todavía hay poca información sobre este tema en los pacientes coinfectados por VIH/VHC y no hay estudios publicados con un gran número de pacientes.
El objetivo del presente estudio fue investigar la TB en pacientes coinfectados por VIH/VHC y explorar posibles asociaciones entre la magnitud de la TB y la gravedad de la enfermedad hepática.
PACIENTES Y MÉTODOS
Pacientes
Se llevó a cabo un estudio transversal en 255 pacientes coinfectados por VIH y VHC del Hospital Gregorio Marañón de Madrid (España), que se habían sometido a una biopsia de hígado entre mayo de 2000 y mayo de 2007. Además, 100 donantes de sangre sanos del «Centro de Transfusión de la Comunidad de Madrid» participaron como grupo control, todos los cuales fueron negativos para el VHC, VHB y VIH [14].
Las biopsias de hígado se realizaron en pacientes que eran candidatos potenciales para la terapia anti- VHC y no habían recibido tratamiento previo con interferón. Los criterios de inclusión fueron: sin evidencia clínica de descompensación hepática, ARN del VHC detectable por reacción en cadena de polimerasa (PCR), antígeno de superficie de hepatitis B negativo, contaje de linfocitos CD4+ mayor de 200 células/µl, terapia antirretroviral estable o sin necesidad de terapia antirretroviral. Los criterios de exclusión fueron: infecciones oportunistas activas o adicción activa a drogas o alcohol.
Los estudios se realizaron de conformidad con la Declaración de Helsinki. Todos los pacientes dieron su consentimiento por escrito para la biopsia hepática y el Comité Institucional de Ética aprobó el estudio.
Datos clínicos y de laboratorio
La siguiente información se obtuvo de las historias clínicas en la fecha de la biopsia hepática: edad, sexo, altura, peso, factor de riesgo, categoría clínica conforme al Centro para el Control de Enfermedades (CDC), nadir CD4+, células T CD4+, terapia antirretroviral, recuentos sanguíneos, la carga viral de ARN-VIH y ARN-VHC, el genotipo de VHC, los resultados de la biopsia del hígado y el panel metabólico básico y hepático.
El Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) se definió según la clasificación del CDC [15]. La duración de la infección por VHC en pacientes con un historial de uso de drogas intravenosas (IDU) fue estimada a partir del primer año en el que se comparten las agujas y demás parafernalia de inyección, que son las prácticas de riesgo más importantes para la transmisión del VHC [16]. Para los pacientes no IDU, obtuvimos la información de la fecha de infección para 2 pacientes que se infectaron por transfusiones de sangre, y para otros 3 pacientes que fueron infectados por contacto sexual y en los que la infección por el VHC se puede fechar con certeza. Los pacientes fueron interrogados en relación con el consumo de alcohol. Se consideró el consumo de más de 50 gramos de alcohol por día durante>= 12 meses como un alto consumo. Las biopsias de hígado se realizaron como se ha descrito previamente [17], y la fibrosis hepática y actividad necroinflamatoria se estimaron de acuerdo con la escala Metavir.
PCR cuantitativa en tiempo-real para la medición del ADN bacteriano
Las muestras de plasma se obtuvieron al mismo tiempo que la biopsia del hígado y se almacenaron a -80 º C. A continuación, se extrajo ADN de 200 µl de plasma utilizando el QIAamp® MiniElute® Virus Spin Kit (Qiagen), en un extractor automatizado QIAcube (Qiagen), según lo recomendado por el fabricante.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo-real se realizó en un Instrumento LightCycler versión 1.5 (Roche Molecular Biochemicals) para amplificar una secuencia de ADN que codifica una región bien conservada de la subunidad 16S ARNr (16S ADNr) como se ha descrito anteriormente [7]. El protocolo de PCR fue el siguiente: 4 ml de TaqMan Master Mix (Roche Diagnostics), 0,5 mM de cada primer, 0,2 mM de la sonda TaqMan y 5 µl de extracto de ADN (o estándar) en 20 µl de volumen total de reacción. Las condiciones para la reacción de amplificación de ADN fueron 95°C durante 10 min, seguido de 45 ciclos a 95°C durante 15 s, 60°C durante 1 min y a 72ºC durante 1 s. Las secuencias de los primers fueron las siguientes: 8F ( 5 ‘- AGT TTG ATC CTG GCT CAG- 3 ‘ ); 515R ( 5 ‘- GWA TTA CCG CGG CKG CTG- 3 ‘ ), y la sonda TaqMan , 338P ( 5 `- FAM- GCT GCC TCC CGT AGG AGT- BHQ1 – 3 ‘ ) [7]. El límite de cuantificación en el ensayo de ADN bacteriano fue de 15 copias/mL.
Resultados medidos de la enfermedad hepática
La fibrosis se valoró de la siguiente manera: F0/F1, sin fibrosis o fibrosis portal, F2, fibrosis periportal o escasos septos portal-portal; F3/F4, septos fibrosos con distorsión de la arquitectura o cirrosis. El grado de actividad se puntuó de la siguiente manera: A0/A1, ninguna actividad o actividad leve, A2, Actividad moderada, A3, actividad severa.
La tasa de progresión de la fibrosis (FPR) se calculó dividiendo el estadio de la fibrosis (0 a 4) por la duración estimada de la infección VHC en años. Varios puntos de corte fueron seleccionados: FPR baja (<0.075 (P50th)), FPR moderada (0,075 (P50th) a 0,15 (P75th)), y de FPR alta (>= 0,15 (P75th)).
Estadística
Los datos categóricos y las proporciones se analizaron mediante el test de chi- cuadrado. Se utilizó la prueba ANOVA para comparar las medias entre los grupos.
Los resultados de la enfermedad del hígado estudiados son variables ordinales, y se utilizó la regresión logística ordinal (OLR) para analizar la asociación entre los niveles plasmáticos de bactDNA y la enfermedad hepática en pacientes coinfectados VIH/ VHC. Uno de los supuestos subyacentes de la OLR es que la relación entre cada par de grupos de resultados es el mismo y asume que los coeficientes que describen la relación entre, la más baja en comparación con todas las categorías superiores de la variable de respuesta son las mismas que las que describen la relación entre la siguiente categoría más baja y todas las categorías superiores.
Para los niveles plasmáticos de bactDNA, se seleccionó un punto corte cerca del percentil 75 (P75th) ya que este punto de corte separa al 25% de los pacientes con los valores más altos de bactDNA en plasma. Por lo tanto, somos capaces de estudiar la relación entre los niveles elevados de bactDNA y una mayor probabilidad de tener enfermedad hepática. Para la ORL ajustada, incluimos bactDNA junto con las características epidemiológicas y clínicas: edad, sexo, alto consumo de alcohol, la glucemia en ayunas (mg/dL), CD4+ nadir, SIDA, CD4+ células/mm3, carga viral del VIH indetectable, cART, VHC genotipo 1, y la carga viral del VHC>=500.000 UI/ml en la fecha de la biopsia.
Todas las pruebas fueron de dos colas con valores de p <0,05 considerados significativos. El análisis estadístico se realizó mediante el programa SPSS 15.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.).
Las características de los pacientes coinfectados VIH/VHC en el momento de la biopsia de hígado se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Características de los 255 pacientes coinfectados VIH/VHC en el momento de la biopsia de hígado.
*Valor absoluto (porcentage). #Mediana (percentil 25; percentil 75). Abreviaturas: ALT: alanina aminotransferasa. AST: aspartato aminotransferasa. GGT: gamma glutamil transpeptidasa. INRT: inhibidores análogos de nucleósidos de la retrotranscriptasa. INNRT: inhibidores no análogos de nucleósidos de la retrotranscriptasa. IP: inhibidores de proteasa. UDVP: usuario de drogas por vía parenteral. VHC: Virus de la hepatitis C. VHC-ARN: carga viral plasmática de VHC. VIH-1: Virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1. VIH-ARN: carga viral plasmática de VIH.
La mediana de edad fue de 39,5 años, el 76% eran varones y el 29% presentó condiciones definitorias de sida previas. En la fecha de la biopsia hepática, la mediana del contaje de CD4+ fue 483 células/mm3, el 70,6% tuvieron ARN-VIH <50 copias/mL, 61.4% pertenecían al genotipo 1 del VHC, y el 73,1 % tenían ARN-VHC> 500.000 UI/mL. En total, el 84,7% de los pacientes estaban en cART: 23,5% con tratamiento basado en inhibidores de la proteasa, el 47,8% en tratamiento con análogo no nucleósido, y el 13,3% en tratamiento con 3 análogos de nucleósidos. Por otra parte, el 53,3% de los pacientes mostraron fibrosis significativa (F>=2), el 26,6% fibrosis avanzada (F>=3) y el 55,1% un grado de actividad moderada (A>=2).
La prevalencia de PCR positiva para bactDNA en plasma fue significativamente mayor en los pacientes coinfectados VIH/VHC que en los donantes de sangre sanos (244/255 (95,7%) frente a 7/100 (7%), respectivamente, p<0,001). Por otra parte, los pacientes con CD4+ <350 células/mm3 tuvieron niveles de bactDNA en plasma significativamente superiores a los pacientes cuyos CD4+>= 350 células/mm3 (157,1±28,2 frente a 112,8±7,2 respectivamente, p= 0,030). Por otra parte, los niveles de bactDNA no fueron mayores en los pacientes que tenían ARN-VIH detectable y el nivel no dependía del nivel de plasma de ARN-VIH (datos no presentados).
Los pacientes con marcadores de enfermedad hepática avanzada (F3/F4 y A2/A3) y alta FPR (>=0,15) tuvieron valores más altos en plasma de bactDNA que los pacientes sin estos marcadores de enfermedad hepática (Figura 1A). Nótese que A3 tenía un valor de p cercano a la significación estadística (p= 0,083). Además, se puede observar que los pacientes con valores de bactDNA superiores a 175 copias/µl tenían una tendencia a la enfermedad del hígado, mientras que otros valores de corte no mostraron una tendencia tan clara (Figura 1B).
Figura 1. Resumen de los niveles en plasma de ADNr 16S de acuerdo a los marcadores de la enfermedad hepática en pacientes coinfectados por VIH/VHC.
(A), media y error estándar de los niveles de plasma de ADNr 16S. Los valores de significación estadística se calcularon con respecto a la categoría de enfermedad más leve. (B), distribución de los pacientes según la categoría de la enfermedad y del percentil de los niveles plasmáticos de ADNr 16S (P25th (50 copias/µl), P50th (85 copias/µl), y P75th (175 copias/µl)). Los valores de significación estadística se calcularon sobre todas las categorías de la enfermedad hepática mediante la prueba de asociación chi-cuadrado lineal por lineal. La fibrosis se valoró de la siguiente manera: F0/F1, sin fibrosis o fibrosis portal; F2, fibrosis periportal o escasos septos portal-portal; F3/F4, septos fibrosos con distorsión de la arquitectura o cirrosis. El grado de actividad se puntuó de la siguiente manera: A0/A1, sin actividad o actividad leve; A2, actividad moderada; A3, actividad severa. La tasa de progresión de la fibrosis (FPR) se puntuó como sigue: FPR baja (<0.075 (P50th)), FPR moderada (0.075 (P50th) to 0.15 (P75th)), y FPR alta (>=0.15 (P75th)).
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También se analizó la influencia de bactDNA en plasma en la enfermedad hepática mediante análisis OLR. Con respecto a la fibrosis, la probabilidad de sufrir un incremento en el estadio Metavir fue 1,20 (95% de intervalo de confianza (IC 95%)= 1,0 a 1,44), p= 0,045) veces mayor por cada 100 copias/µl de bactDNA en plasma. Por ejemplo, por cada 100 copias/µl de bactDNA en plasma, el ratio de F3/F4 frente a F2 y F0/F1 era 1.20 y las probabilidades de tener F2 frente a F0/F1 también fue 1,20. Del mismo modo, las probabilidades de tener un mayor grado de actividad fue de 1,22 (IC 95%= 1,1 a 1,45), p= 0,029) y de tener valores de FPR>0,15 o 0,075-0,15 frente a FPR<0,075 fue 1,18 (IC 95%= 0,98-1,42), p= 0,089) veces mayor por cada 100 copias/µl de bactDNA en plasma. Además, los pacientes con niveles plasmáticos de bactDNA elevados (>=175 copias/µl) tuvieron la prevalencia y las probabilidades mayores de tener altos valores de puntuación Metavir y FPR (Tabla 2).
Tabla 2. Prevalencia de niveles plasmáticos de ADNr 16S baja (<p75th) y alta (>=p75th) dentro de cada estadio de la enfermedad hepática, y probabilidades de encontrar enfermedad hepática y alta tasa de progresión de la fibrosis en pacientes con altos valores de ADNr 16S en plasma (p75th>=).
| p75th de ADNr 16S | No ajustado | Ajustado | |||||
| <175 copias/µL | >=175 copias/µL | valor-p (*) | OR (IC 95%) | valor-p (†) | OR (IC 95%) | valor-p (‡) | |
| FPR | |||||||
| <0.075 | 85 (47.2%) | 15 (34.9%) | |||||
| 0.075 – 0.15 | 61 (33.9%) | 10 (23.3%) | 0.009 | 2.44 (1.35; 4.41) | 0.003 | 2.05 (1.09; 3.86) | 0.026 |
| >=0.15 | 34 (18.9%) | 18 (41.9%) | |||||
| Grado de actividad | |||||||
| A0/A1 | 102 (49.3%) | 12 (25.5%) | |||||
| A2 | 77 (37.2%) | 27 (57.4%) | 0.017 | 2.13 (1.17; 3.88) | 0.013 | 1.97 (1.04; 3.73) | 0.038 |
| A3 | 28 (13.5%) | 8 (17%) | |||||
| Fibrosis | |||||||
| F0/F1 | 105 (50.5%) | 14 (28.8%) | |||||
| F2 | 55 (26.4%) | 13 (27.7%) | 0.013 | 2.26 (1.22; 4.21) | 0.010 | 2.03 (1.04; 3.96) | 0.037 |
| F3/F4 | 48 (23.1%) | 20 (42.6%) |
Abreviaturas: OR, odds ratio; IC 95%, intervalo de confianza de 95%. La fibrosis se valoró de la siguiente manera: F0/F1, sin fibrosis o fibrosis portal; F2, fibrosis periportal o escasos septos portal-portal; F3/F4, septos fibrosos con distorsión de la arquitectura o cirrosis. El grado de actividad se puntuó de la siguiente manera: A0/A1, sin actividad o actividad leve; A2, actividad moderada; A3, actividad severa. La tasa de progresión de la fibrosis (FPR) se puntuó como sigue: FPR baja (<0.075 (P50th)), FPR moderada (0.075 (P50th) to 0.15 (P75th)), y FPR alta (>=0.15 (P75th)).
(*), El valor de significación estadística se calculó mediante la prueba de chi-cuadrado de asociación lineal por lineal, (†), el valor de significación estadística se calculó mediante la prueba de regresión logística ordinal; (‡), el valor de significación estadística se calculó mediante la prueba de regresión logística ordinal ajustada.
DISCUSIÓN
Determinamos los niveles plasmáticos de bactDNA en un grupo de 255 pacientes coinfectados VIH/VHC con enfermedad hepática compensada que se sometieron a una biopsia hepática, con el fin de determinar su idoneidad para ser sometidos a terapia con interferón más ribavirina. Los pacientes coinfectados VIH/VHC tenían niveles plasmáticos de bactDNA más altos que los controles sanos, y los pacientes con CD4+ <350 células/mm3 tuvieron mayor bactDNA en plasma que aquellos con CD4+>= 350 células/mm3. Además, se encontró una asociación entre los niveles más altos de bactDNA en plasma con enfermedad hepática avanzada y más rápida progresión a fibrosis.
La fuente más probable de estos productos bacterianos es el tracto gastrointestinal, en el que las defensas de la mucosa están profundamente alteradas por la infección por VIH [5]. Nuestros resultados, así como los datos emergentes de otros investigadores [7, 11, 15, 18], indican que los productos bacterianos se encuentran a menudo circulando en el plasma de pacientes infectados por el VIH y en pacientes coinfectados VIH/VHC. Nuestro hallazgo de una asociación entre los niveles más bajos de células CD4+ y los valores plasmáticos bactDNA mayores apoyan la idea de que en los pacientes infectados por el VIH en cART, los niveles plasmáticos de bactDNA se correlacionan con el contaje de CD4+, la magnitud de la reconstitución inmune de CD4+, y los marcadores de activación inmune [7]. Esto es interesante porque la BT, el agotamiento de los linfocitos CD4+ y la activación inmune pueden contribuir a la progresión de la enfermedad de hígado entre los pacientes coinfectados VIH/VHC [11, 19].
En nuestro estudio, hemos confirmado la asociación entre los niveles más altos en plasma de bactDNA y grados más altos de inflamación y estadios superiores de fibrosis en las biopsias hepáticas de pacientes coinfectados VIH/VHC. Por otra parte, nuestros datos muestran una asociación significativa entre los niveles de bactDNA y FPR lenta en estos pacientes. La mayoría de los estudios anteriores no analizaron el papel de estos niveles de bactDNA con FPR, que es una medida sólida del riesgo de progresión de la cirrosis. No obstante, consideramos FPR como una medida indirecta que tiene algunas limitaciones, como el supuesto de una tasa de progresión constante. Un método directo, utilizando biopsias de hígado en serie y el intervalo entre dos biopsias adyacentes, tiene la capacidad de calcular las tasas de transición de una etapa específica, pero es muy difícil compilar pacientes con más de una biopsia. A pesar de esta limitación, creemos que los niveles plasmáticos de bactDNA podrían añadir información valiosa a los factores que influyen en FPR y pueden ser útiles para poner en práctica las intervenciones terapéuticas específicas en pacientes VIH con infección por el VHC en riesgo de progresión de la enfermedad hepática rápida.
Por desgracia, nuestro diseño del estudio no permite evaluar si la BT es una causa o una consecuencia de la progresión de la enfermedad hepática. Sin embargo, hay algunas evidencias de que la BT promueve la fibrogénesis hepática, lo que aumenta, en última instancia, la derivación portal sistémico (una consecuencia bien conocida de cirrosis) y la abundancia de productos microbianos circulantes en un bucle de retroalimentación positiva [11]. Además, la presencia de bactDNA en pacientes con cirrosis se asocia con consecuencias hemodinámicas, tales como la agravación de la vasodilatación periférica y el empeoramiento de la disfunción endotelial intrahepática [20].
En conclusión, a pesar de que las diferencias observadas entre los pacientes con diferentes estadios y tasas de progresión de la enfermedad son modestos, nuestros datos muestran que la BT se asoció con enfermedad hepática severa en los pacientes infectados por VIH con hepatitis crónica C. Se necesitan estudios futuros para validar estos resultados y para evaluar si los niveles plasmáticos de bactDNA son un marcador predictivo y/o sustituto de la enfermedad hepática en pacientes coinfectados por VIH/VHC.
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