La instrumentación del laboratorio de cultivo celular

Incubadores

– Se trata de equipos comunes a la mayor parte de los laboratorios de biología (estufas, baños termostatizados,…) con la excepción del incubador de CO2, y del incubador con “roller”.
– Las células en cultivo son capaces de soportar sin daños importantes variaciones de temperatura, siempre que sean por debajo de la temperatura corporal del animal del que proceden. Así pues las células humanas soportan incubaciones a 4 ºC durante dias y pueden ser congeladas a -196 ºC durante años (con sustancias preservantes). Sin embargo no sobreviven más de unas pocas horas a variaciones de 2 ºC por encima de 37ºC. Las células procedentes de animales poiquilotermos soportan mejor un amplio rango de temperaturas de incubación.
– Las células de homeotermo suelen crecer bien entre 33 y 37 ºC, pero en ese margen presentan importantes variaciones en su tasa de crecimiento. En un incubador de células es por tanto más importante la consistencia de la temperatura (invariabilidad durante prolongados periodos de tiempo, con oscilaciones inferiores a 0.5 ºC) que su precisión a fin de mantener a las células en condiciones en las que las tasas de crecimiento sean constantes. Por ello se deben usar incubadores con movimiento de aire forzado en el interior, y colocar los contenedores de células sobre estanterias agujereadas y nunca sobre el fondo o las paredes del incubador.
– Las necesidades de asepsia en el incubador son considerablemente menores que en el área de trabajo (cabina de flujo laminar) pero sin embargo es muy recomendable mantener una estricta limpieza, desinfección periódica del incubador, y especialmente no introducir, o eliminarlos inmediatamente, cultivos contaminados en el incubador.
– Para determinar el número y tipo de los incubadores requeridos se tendrá en cuenta :
– – el tipo de cultivos a realizar: primarios o de líneas celulares estables. Es conveniente no cultivar en el mismo incubador cultivos primarios con líneas celulares estables, pues los primeros son una importante fuente de contaminación.
– – la especie y el tipo de células a cultivar. Es importante la determinación exacta de la temperatura de incubación para la que se tendrá en cuenta la temperatura corporal del animal del que proceden las células, así como cualquier variación regional de temperatura (la piel suele tener una temperatura inferior). Algunos autores sugieren incorporar asimismo un factor de seguridad a la temperatura de incubación. Por ejemplo para la incubación de células humanas sugieren el cultivo a 36.5 ºC, cercano al valor de la temperatura corporal pero un poco inferior para mayor seguridad. Esto es en la actualidad innecesario en los incubadores modernos, capaces de regular la temperatura de incubación con gran precisión. Así pues serán necesarios tantos incubadores como diferentes temperaturas de incubación se precisen.

Incubador de CO2

– El mantenimiento de la temperatura en una atmósfera con una tensión controlada de CO2 y adicionalmente de humedad elevada es el objetivo del incubador de CO2.
– Las condiciones del cultivo: temperatura, humedad atmosférica y niveles de CO2 son característicos de cada línea celular.
– El nivel de CO2 se establece para mantener el equilibrio carbonato-bicarbonato en el medio de cultivo, habitualmente al 5%.

Incubador de CO2: dispositivos

– Dispositivos de control de temperatura, con un termostato de seguridad que desconecta la función en caso de anomalía. La estabilidad de la temperatura es una característica esencial del incubador, y por ello suelen estar equipados con camisas de agua (‘water jacketed’) que incrementan notablemente la inercia térmica. Como consecuencia la estabilización de un incubador puede tardar varios días.
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– Dispositivo de inyección de una mezcla de aire y CO2, en la proporción deseada, entre el 4 y el 7 %. El CO2 de elevada pureza se suministra en botellas presurizadas, y se mezcla en el dispositivo de inyección. El control de la mezcla se realiza fundamentalmente mediante un dispositivo IRGA (“infra-red gas analyzer”) . En incubadores modernos este dispositivo analiza constantemente el porcentaje de CO2 presente en la cámara de incubación, y realiza las correcciones necesarias. Un problema usual del dispositivo de medida de CO2 es la pérdida de calibración que se produce periódicamente. para evitarlo algunos fabricantes dotan al sistema de un mecanismo de autocalibración periódica (basado en la toma de una muestra de aire exterior que se considera tiene un valor x de CO2).
– Dispositivo de control de la humedad ambiente. Para mantener el cultivo se requiere una humedad ambiente elevada, a fin de reducir la evaporación de agua del medio de cultivo. En los incubadores menos sofisticados esto se consigue mediante bandejas de agua en el fondo del incubador. Este recurso es peligroso pues son una fuente importante de contaminaciones al convertirse a los pocos dias en caldos de cultivo. En los instrumentos más modernos se dispone de dispositivos que controlan la humedad atmosférica, inyectando agua estéril y filtrada.
– Dispositivo de recircularización de aire. Es importante una recirculación del aire en el interior del incubador, a fin de homogeneizar la temperatura en su interior. Si además en el circuito de circulación de aire se intercala un filtro HEPA se consiguen eliminar las posibles partículas contaminantes, y se asegura la esterilidad del ambiente.
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Incubador de CO2: seguridad

– La limpieza y la desinfección, periódicas y sistemáticas, son el método recomendable para reducir los riesgos derivados de la contaminación accidental del personal del laboratorio.

Incubador “roller”

– Se trata de un incubador o estufa, en el interior del cual se ha instalado un “rotor” de baja velocidad. Se utiliza para mantener cultivos en botellas cerradas (no requieren CO2).
– La finalidad es disponer de una gran superficie para la adhesión de las células.
– En estos instrumentos se incuban las células en el interior de ‘roller bottles’, botellas con una gran superficie de crecimiento.
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Instrumentos ópticos de observación: microscopio de contraste de fases invertido

– El control morfológico del cultivo se realiza mediante el uso de un microscopio. El hecho de que las muestras a observar se encuentren en recipientes de un cierto grosor (más de 3 cm en el caso de frascos de Roux de 250 ml) hace que un microscopio convencional no sea adecuado (por su pequeña distancia frontal), por lo que se han desarrollado microscopios de diseño original, en los cuales la fuente de iluminación y los objetivos se encuentran invertidos respecto a la platina de un microscopio óptico convencional.
– Ausencia de color, es decir se trata de muestras vivas y con poco contraste. El microscopio se equipa con el dispositivo de contraste de fases (diafragmas anulares a nivel del condensador y placa de fases entre las lentes del objetivo). De esta forma el contraste de la imagen aumenta y la calidad obtenida es muy superior.
– Es de gran utilidad disponer asimismo de un dispositivo de captación de imágenes, fotográfico o de video acoplado al microscopio a fin de documentar el estado de los cultivos.

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Congeladores e instalación de criogenia (depósito de N2 líquido)

– Es recomendable que los congeladores y la instalación de criogenia estén en recintos separados a la unidad de cultivo propiamente dicha pues los ventiladores y compresores son una fuente importante de turbulencias y suciedad en el laboratorio.
– Es preciso el almacenamiento de soluciones y células a diferentes temperaturas, para lo que se requiere :
– neveras (4 ºC) para el almacenamiento de medios, PBS, …
– congeladores de -20 ºC para el almacenamiento de suero, aditivos (glutamina, antibióticos) y soluciones enzimáticas (tripsina, colagenasa,…).
– congeladores de -80 ºC para el almacenamiento a largo plazo de los aditivos del medio (suero, glutamina, antibióticos,…) y de sustancias especialmente sensibles (factores de crecimiento, mitogenos, inductores,…).
– unidad de almacenamiento en nitrógeno líquido (-196 ºC), para el almacenamiento de las líneas celulares.

Congeladores: seguridad

– La congelación es un proceso que mantiene la viabilidad de muchos agentes infecciosos, de ahí un potencial riesgo y las siguientes recomendaciones:
– Tratar de identificar en ficheros, listas, etc. el contenido de lo almacenado y sus riesgos potenciales.
– El material potencialmente infeccioso debe colocarse en tubos, recipientes, etc. bien cerrados. No se llenarán completamente, para evitar que rebosen por efecto del aumento de volumen tras la congelación.
– Descongelar periódicamente, limpiar y desinfectar si fuese procedente.
– Utilizar guantes para manipular el contenido. Si la temperatura es baja (por ejemplo -70ºC o inferior), los guantes representan una protección adicional.

NITRÓGENO LÍQUIDO: seguridad

– El nitrógeno es, químicamente, un gas muy estable e inerte y no está considerado peligroso. Sin embargo, en su forma líquida, el N2 tiene varios peligros: a) quemaduras por congelación, b) riesgo de asfixia por desplazamiento del oxígeno y c) posibilidad de rotura de los contenedores por exceso de temperatura. De todos ellos, el peligro más real en el Laboratorio de Microbiología lo representan las quemaduras por frío.
– El N2 licuado tiene un punto de ebullición de -196ºC y la fase de vapor de los contenedores suele estar a una temperatura inferior a -180ºC. La exposición de la piel y mucosas puede provocar lesiones graves, similares a las quemaduras, por lo que debemos manipular este producto adecuadamente.

NITRÓGENO LÍQUIDO: seguridad

– Las normas básicas de protección son:
– No se manipulará nunca el N2 líquido con partes del cuerpo descubiertas. Se deberá utilizar siempre un equipo de protección personal.
– La ropa debe estar limpia y seca, y no estar ceñida al cuerpo, sino holgada.
– Los brazos y manos deben estar cubiertos por guantes aislantes, de un material que no se resquebraje por acción de la temperatura.
– Las piernas han de estar protegidas. Hay que usar un calzado cerrado, en buen estado, con suelas gruesas.
– Se utilizará un protector facial; las gafas se consideran una protección incompleta.
– Si se produce la exposición accidental, nunca debe aplicarse agua caliente o calor directo sobre la zona expuesta; es mejor llevar al accidentado a una habitación caldeada y aplicar agua tibia. Si la exposición es grave, puede requerir tratamiento médico especializado.

NITRÓGENO LÍQUIDO: seguridad

– La falta de oxígeno, desplazado por los gases criogénicos, como el N2 líquido, es un peligro recalcado por todas las normativas de seguridad y que generalmente se menosprecia. Un litro de este líquido puede generar casi 700 de gas. Una atmósfera con un contenido de oxígeno inferior al 15% puede producir asfixia. En consecuencia, los recipientes y contenedores de N2 líquido deben estar siempre colocados en una zona bien ventilada.
– Por último, aunque el N2 no es inflamable ni explosivo, la exposición de los contenedores y recipientes al calor directo puede originar una sobrepresión que rompa bruscamente las paredes, con el consiguiente riesgo de vertido accidental y salpicaduras. En consecuencia, los recipientes deben estar lejos de cualquier fuente de calor y nunca debe colocarse objetos pesados encima de las tapas de estos recipientes.

NEVERAS Y HABITACIONES FRIGORÍFICAS

– Un adecuado mantenimiento, limpieza y desinfección sistemáticos de los aparatos reduce considerablemente los riesgos asociados a su utilización. Sin embargo, aun en estas condiciones, hay que tener en cuenta lo siguiente:
– No deben almacenarse cultivos de microorganismos patógenos por inhalación en recipientes que no estén convenientemente cerrados, especialmente si la cámara tiene un sistema de circulación de aire.
– No deben almacenarse reactivos que contengan compuestos volátiles inflamables (éter etílico, por ejemplo) en neveras que no posean un sistema de protección antideflagración. En los aparatos de tipo doméstico que se utilizan en el laboratorio debe anularse la lámpara de la luz.

Equipo de esterilización: autoclave y equipo de filtración

– La necesidad de asepsia para el cultivo de tejidos se extiende no sólo al medio en que se realiza el trabajo sino muy especialmente a los recipientes en que se realiza el cultivo, a los medios líquidos o sólidos, y a los instrumentos que puedan entrar en contacto con éste en algún momento de su manipulación (pipetas, puntas de pipeta automática, pinzas, tubos, material variado de vidrio…).
– Para esterilizar todo este material, de variada naturaleza se emplean una serie de métodos : irradiación con radiación gamma o rayos X, esterilización por gas, autoclavado, filtración,…
– En el laboratorio general de cultivo de tejidos se suele disponer de : equipo de filtración y autoclave.
– La esterilización por gas, y la irradiación son técnicas propias de grandes instalaciones, por ejemplo hospitalarias, o industriales.

Equipos de filtración

– En la actualidad se dispone de unidades de filtración estéril (por ej. Millipore, Gelman, …), muy recomendables para el trabajo rutinario. Sin embargo, su elevado coste por unidad hace que en muchos casos aún se empleen unidades reutilizables como pueden ser las unidades Swimmex de Millipore.
– Estos equipos de filtración constan o bien de una fuente de vacio conectada a un kitasato dotado de una unidad de filtración esterilizada por autoclavado, o bien de una bomba peristaltica que fuerza el flujoo de solución a través de una unidad de filtración hermética (por ejemplo las ya citadas Swimmex de la empresa Millipore). En ambos casos la esterilización se produce al atravesar la solución un filtro de poro 0.22 um.

Autoclave

– Un autoclave es un instrumento que permite la esterilización por calor tanto de sólidos como de líquidos. La esterilización se realiza habitualmente a 121 ºC, 1 atmosfera de sobrepresión durante un tiempo superior a 20 min. Un autoclave de uso normal en el laboratorio de cultivo de tejidos suele disponer de temporizador y regulador de presión, y en algunos casos de un ciclo de secado para permitir secar el material sólido (material de vidrio, instrumentos quirúrgicos, tubos,…).

Autoclave: seguridad

– Los autoclaves deben poseer manómetro y termostato, así como válvula de seguridad, sistema de desconexión rápido y la purga del vapor ha de realizarse a un recipiente estanco y con agua, jamás directamente al exterior.
– No deben usarse si no se conocen perfectamente todos los mandos y su fundamento.
– Usar guantes especiales para protegerse del calor.
– No abrir jamás si el manómetro no está a “0” y la purga no ha sido abierta.
– Controlar una vez al mes su capacidad de desinfección mediante esporas, no siendo suficiente el método químico. El uso de registros de presión y temperatura de cada proceso y la instauración de un programa de mantenimiento también puede ser una alternativa válida al control mediante esporas. El agua debe ser cambiada regularmente.

Centrífugas

– En el laboratorio de cultivo de tejidos es necesario disponer de una centrífuga refrigerada, preferentemente con posibilidades de usar en ella desde tubos de pequeño volumen (1 a 2 ml) a botellas de gran capacidad (250 a 500 ml). Normalmente, para la mayor parte de las aplicaciones bastará con un instrumento que desarrolle hasta 2000 xg.
– La centrífuga se ha de instalar dentro de lo posible alejada de las cabinas de flujo laminar, para evitar las turbulencias de aire que genera.
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Centrífugas: seguridad

– Los mayores riesgos derivan, sobre todo, de la contaminación por los aerosoles generados durante la centrifugación de materiales biológicos y, en menor medida, de los traumatismos accidentales. Se recomienda:
– Cuando se centrifugue material biológico potencialmente infeccioso deben utilizarse tubos cerrados; la centrífuga debe disponer de rotores o cestillos de seguridad que protejan al operador de los posibles aerosoles.
– La rotura accidental de un tubo y su vertido en la cubeta representa una incidencia importante que debe ser comunicada inmediatamente al Supervisor o responsable, de forma que se proceda a la desinfección segura del aparato.
– No se deben utilizar centrífugas antiguas que no posean sistema de cierre de seguridad, del que disponen todos los aparatos actuales, ni manipular éstas de forma que permitan su apertura mientras están en funcionamiento.
– Si el laboratorio dispone de ultracentrífugas, el equilibrado cuidadoso del rotor es fundamental.

Contador electrónico de células (“cell counter”)

– Un contador electrónico de células es un instrumento capaz de contar y medir partículas en suspensión. Este instrumento fue comercializado por Coulter Electronics, y a pesar que posteriormente se han desarrollado métodos alternativos es aún hoy en día el mecanismo más empleado.
– El sistema está formado por los siguientes elementos:
– 1. dos electrodos, uno en el interior de un tubo con un pequeño orificio que se introduce en la suspensión de partículas a contar, y un segundo electrodo que se introduce directamente en dicha suspensión. El tubo con el orificio está conectado a un manómetro de mercurio y a una bomba. El manómetro controla mediante el desplazamiento del mercurio la conexión y desconexión de los electrodos.
– 2. un amplificador electrónico de la señal, un analizador de altura de los pulsos, y una escala, conectados a los electrodos.
– Cuando la válvula que controla el manómetro se abre 0.5 ml de la suspensión entran en el interior del tubo por el pequeño orificio. Durante ese tiempo los electrodos están conectados y registran y transmiten al equipo de amplificación y análisis de la señal las oscilaciones de resistencia que detectan. Cada vez que una célula atraviesa el orificio se produce una variación de la resistencia proporcional al tamaño. Estos datos se registran y se analizan.
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Cámara de Neubauer

– La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos lineas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L corresponde a 1 milimetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro.
– Si contamos las cuatro áreas sombreadas (L) observando un total de x células entre las cuatro áreas, la concentración en la suspensión celular será:

concentración en la suspensión (células / mL) = 10000 (x/4)

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Equipo de purificación de agua

– Es de gran importancia en la preparación de los medios, de los aditivos, o en cualquier solución que pueda estar en contacto con el cultivo, una absoluta esterilidad y ausencia de sustancias que puedan provocar alguna alteración al cultivo. Por ello se utiliza siempre agua de la máxima calidad (tipo MilliQ, Millipore) obtenida mediante equipos de doble destilación o de intercambio iónico y filtración. Es muy importante la eliminación de apirógenos, y restos de materia orgánica.
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Pipeteadores
– Se trata de dispositivos o instrumentos para el trasvase o medición de fluidos. Los de uso común en el laboratorio como las pipetas automáticas y las pipetas, pero con la salvedad del uso de bombas acopladas a la pipeta, manuales o eléctricas que permiten la aspiración mecánica del fluido. Importante para mantener la asepsia y al mismo tiempo para la protección del operador. El aire bombeado es filtrado previamente.
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