A pesar de la relación establecida entre el uso del correceptor y la progresión de la enfermedad en pacientes VIH-1, la determinación del tropismo viral no se ha utilizado como un parámetro habitual de seguimiento clínico de los pacientes con infección por VIH. Sin embargo, la introducción de los antagonistas de CCR5 dentro de la terapia antirretroviral, y su limitada actividad antiviral para variantes R5-trópicas, requiere del conocimiento previo del uso del correceptor en cada paciente, antes de las prescripción clínica de dichos fármacos.
Existen diversos métodos fenotípicos y genotípicos para determinar el tropismo del VIH-1.
| Método | Metodología | Limitaciones |
| MT-2 | Capacidad de los aislados virales de formar sincitios en células MT-2 | Obtención de los aislados virales |
| Líneas celulares | Capacidad de los aislados primarios o virus recombinantes de replicar en líneas celulares que expresan los receptores CCR5 y CXCR4 en su superficie | Diferentes niveles de correceptores entre las líneas celulares y las dianas naturales del VIH |
| Virus recombinantes | – Trofile (Monogram Biosciences, San Francisco, CA, USA) – PhenoScriptTM (Eurofins-VirAlliance, Kalmazoo, MI, USA) – Antivirogram (Virco BVBA, Mechelen, Bélgica) – PhenX-R (InPheno, Basel, Suiza) – Veritrop (Dyagnostic Hybrids, Cleveland, OH, USA) – Tropitest HIV (Instituto de Salud Carlos III, Madrid, España) |
Umbral de detección de virus X4 en una población mixta de virus (R5+X4). Necesidad de instalaciones y personal cualificado para su desarrollo en centros de referencia. |
| Predicción del fenotipo en la región V3 | Identificación de residuos en V3 que influyen fuertemente el uso viral del correceptor | Baja sensibilidad para la detección de variantes X4. Pocos datos que relacionan el fenotipo virtual y el fenotipo real |
Métodos fenotípicos:
A) Ensayo con células MT-2 para determina el efecto citopático de los aislados virales, estableciendo la clasificación de las cepas virales como IS y NIS. El ensayo MT-2 se basa en que estas células expresan únicamente en su superficie celular el correceptor CXCR4 y no el CCR5, de modo que la replicación viral refleja de un modo indirecto la presencia de virus X4.
Se cocultivan 2×106 CMSP del paciente con 2×106 CMSP de un donante sano previamente estimuladas con fitohemaglutinina (PHA) (blastos) en placas de 24 pocillos con 2 ml medio RPMI suplementado con 20% de FCS y 20U/ml de IL-2. Semanalmente se añaden 2×106 de blastos en 1ml de medio fresco, y dos veces por semana se recogen los sobrenadantes para determinar la concentración de Ag p24. La detección y cuantificación de Ag p24 se realiza mediante un enzimoinmunoensayo tipo «sándwich» para la detección de antígenos asociados al virus VIH (INNOTEST HIV Antigen mAb, INNOGENETICS).
A partir de un cultivo de células MT-2 en fase de crecimiento exponencial, se extraen células para una posterior incubación de 2×105 células MT-2/pocillo con el sobrenadantes provenientes del cultivo de aislamiento del virus (1 ml) o con células mononucleares de sangre periférica (CMSP) obtenidas del cocultivo, en una microplaca de 24 pocillos. Se consideraron como aislados inductores de sincitios (IS), los cultivos en los que al microscopio se observaban células multinucleadas gigantes o sincitiales y tenían valores de Ag p24 detectables. Como control de seguimiento del cultivo y de las características de los aislados virales se usaron las cepas virales BAL (R5 o NSI) y pNL-4.3 (X4 o SI).
La principal desventaja de este ensayo es la necesidad de stocks virales a partir de CMSP de los pacientes, proceso laborioso que requiere personal cualificado, lo que limita el uso de este ensayo para la determinación del tropismo en la práctica clínica. Además, no permiten estudios a gran escala.
B) Ensayos en líneas celulares
– Ensayo con células GHOST, las cuales constituyen una línea celular derivada del osteosarcoma humano (HOS) que expresa en su superficie celular CD4 y varios receptores de quimiocinas (CCR5, CCR3, CCR5, CXCR4).
– Ensayo con células U87, derivada de un glioma maligno y modificadas genéticamente para expresar CD4 y varios receptores de quimiocinas en su superficie celular. U87 es actualmente la línea celular más utilizada para determinar el tropismo del VIH ya que presenta algunas ventajas como su capacidad para crecer en superficies sólidas, lo cual es preferible a los cultivos en suspensión para muchos métodos de detección. Además, las células U87 sostienen una elevada replicación del VIH-1, manteniendo de forma estable los niveles de expresión de los distintos receptores celulares, circunstancia que tiende a desaparecer en otros tipos celulares.
Una desventaja del uso de líneas celulares es que los niveles de expresión de los receptores situados en la superficie celular podrían diferir de los presentes en las dianas naturales para el VIH-1, y por tanto no reflejar lo que ocurre in vivo.
C) Métodos fenotípicos basados en virus recombinantes:
C1) Método Trofile ® (Monogram Biosciences)
El ensayo de Trofile ® es muy utilizado para determinar el tropismo viral en todos los ensayos con antagonistas de correceptores incluyendo MVC y VCV. Por tanto, actualmente, es el único método validado para la determinación del tropismo en la práctica clínica y por ello, es el que se utiliza para determinar el uso del correceptor en todos aquellos pacientes que planean iniciar MVC como parte de su terapia antirretroviral. Estos ensayos fenotípicos amplifican el gen de la glicoproteína de la envuelta a partir de muestras de plasma de pacientes infectados, para producir virus recombinantes con replicación competente o replicación defectiva. Los virus generados son usados para infectar líneas celulares que expresan CD4 y uno de los correceptores, CCR5 o CXCR4, lo que permite determinar el tropismo viral. El gen indicador utilizado en cada método, permite clasificar a los distintos aislados virales como R5-trópicos, X4- trópicos o aislados dual-mixtos.
Los ensayos basados en virus recombinantes permiten estudios a gran escala, pero el límite de detección de cepas minoritarias X4-trópicas presentes en la población viral de un individuo es bajo. Actualmente, el límite de detección para variantes virales minoritarias en el ensayo de Trofile está por debajo del 1%.
El ensayo de Trofile tiene algunas limitaciones tales como:
– Su elevado coste.
– Dificultades técnicas.
– El tiempo hasta la obtención de un resultado ya que sólo se realiza en USA (Monogram Biosciences Inc., South San Francisco, CA) y esto exige el trasporte de la muestra con lo que el resultado final puede tardar entre 4-6 semanas.
-Acceso es muy limitado para países en desarrollo por su elevado coste y sin apoyo logístico para el transporte de muestras.
Entorno al 20% los resultados suministrados por el ensayo son indeterminados («no reportables»).
– Generalmente para que el ensayo funcione se requiere que la viremia del paciente sea superior a 1000 copias de RNA vírico/ml, lo que limita el uso de MRV en pacientes con viremias más bajas, que están en fracaso virológico y con escasas opciones terapéuticas, en diferentes estudios.
– Se ha observado que entorno al 10% de los pacientes, presentan un «cambio» de tropismo (de R5 a dual/mixto, o X4), entre dos muestras separadas en torno a un mes, probablemente debido a problemas de sensibilidad de la técnica, lo que genera incertidumbre sobre la reproductibilidad del Trafile® en algunos pacientes.
– Si el resultado es clasificado como «dual/mixto», el ensayo no suministra información sobre la proporción de cuasiespecies R5 y X4, cuando ya ha sido comunicado que estos pacientes tienen una distribución de tropismos heterogénea, con claro predominio de R5, algunos de los cuales quizás pudieran beneficiarse del tratamiento con MRV.
Se ha comunicado también que el 7% de sujetos nunca expuestos a quimiantagonistas y con tropismo R5, presentan mutaciones de resistencia a MRV en la región V3. Así, estos pacientes podrían ser inadecuadamente tratados con MRV, en base al resultado del Trafile®.
C2) Método TROCAI
Aunque el ensayo fenotípico Trofile® aporta información para la determinación del tropismo del VIH en pacientes infectados, persiste el problema de la determinación precisa de las cuasiespecies virales y de sus proporciones relativas mediante un método que sea, además, de bajo coste, sencillo y que solucione los inconvenientes que se han descrito en el estado de la técnica.
El método TROCAI indentifica el tropismo del VIH superando muchos de los inconvenientes del método Trofile:
a) Cocultivar células aisladas mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de un paciente infectado con el virus VIH y PBMCs de un sujeto control sano, donde las células PBMCs CD8 positivas del paciente infectado con VIH y del sujeto control sano han sido previamente eliminadas de manera selectiva.
b) obtener las partículas virales infectivas liberadas al medio en el que se cocultivan las células del paso (a)
c) inocular mediante espinoculación las partículas virales, obtenidas en el paso (b), a al menos dos líneas celulares humanas aisladas CD4 positivas, donde una de ellas expresa el correceptor CCR5, pero no expresa el correceptor CXCR4 (células CD4+/CCR5+/CXCR4-) y la otra expresa el correceptor CXCR4, pero no expresa el correceptor CCR5 (células CD4+/CCR5-/CXCR4+)
d) cultivar las líneas celulares inoculadas en el paso (c) de manera independiente, y en condiciones apropiadas para la infección viral.
e) determinar la concentración de las partículas virales liberadas (carga viral) al medio de cultivo de las células CD4+/CCR5+/CXCR4- y/o al de las células CD4+/CCR5-/CXCR4+ cultivadas en el paso (d), para la determinación del tropismo viral mediante la cuanti?cación de la proporción de cuasiespecies víricas que utilizan uno u otro correceptor.
TROCAI permite determinar el tropismo R5 y/o X4 del virus VIH en un 91 % de los casos de 33 pacientes infectados, en contraste con el 72,7% que se consigue determinar con el método Trafile. Al contrario que con el método Trafile, no es necesario que la viremia del paciente sea superior a 1000 copias de RNA vírico por ml_. Con TROCAI se ha conseguido determinar el tropismo del virus VIH en pacientes con carga viral menor de 1 000 copias e incluso menor de 500 copias. Esta ventaja permite determinar el tropismo del virus de pacientes infectados con una viremia baja, que están en fracaso virológico y, al no poder determinarse dicho tropismo con el método Trafile, tendría escasas opciones terapéuticas. En resumen, con el método TROCAI demuestra que el 100% de los casos estudiados tiene una clara correlación entre los porcentajes obtenidos por TROCAI y la respuesta virológica a una exposición a corto plazo a MRV, sin ningún desemparejamiento entre ellos.
Adicionalmente, los resultados obtenidos por este ensayo son muy concordantes con TROFILE® y los enfoques genotípicos. Los procedimientos de cultivo celular usados en el método TROCAI son más accesibles, fáciles y económicos, que los procedimientos moleculares.
D) Métodos genotípicos.
El tropismo viral se puede determinar a través de métodos genotípicos basados en algoritmos matemáticos que predicen el fenotipo viral (IS/NIS) o el uso del correceptor (X4/R5) de los aislados virales. La región V3 de la glicoproteina de la envuelta gp120 es el principal determinante del tropismo del VIH-1 por los receptores de CCR5 y CXCR4. Desde hace unos años, se han determinado residuos de interés y patrones del dominio V3 que pueden predecir el fenotipo de una determinada cepa viral a través de un algoritmo. La “regla 11/25” es la primera herramienta genotípica descrita que identifica a una variante como X4-trópica por la presencia de aminoácidos básicos en las posiciones 11 y/o 25 de la región V3. Sin embargo, actualmente existen algoritmos más complejos que utilizan diferentes métodos estadísticos para evaluar distintas posiciones y patrones de aminoácidos de la región V3 con el fin de mejorar el valor predictivo.
Otra aproximación genotípica es la secuenciación «ultra deep», pero esta técnica es cara y no aplicable en la práctica clínica.
La utilización de herramientas genotípicas evita la necesidad de obtener aislados virales primarios o la generación de virus recombinantes; en este caso, es suficiente con amplificar y secuenciar la región V3 de la envuelta del VIH-1 a partir de ARN extraído de plasma o de ADN extraído de CMSP. En la actualidad, existe un especial interés en conocer la exactitud y concordancia entre las herramientas genotípicas y las fenotípicas.
Referencias
1. Munoz-Fernandez MA, Obregon E, Navarro J, et al. Relationship of virologic, immunologic, and clinical parameters in infants with vertically acquired human immunodeficiency virus type 1 infection. Pediatr Res 1996; 40:597-602.
2. Resino S, Gurbindo M, Bellón J, Sanchez-Ramón S, Muñoz-Fernández M. Predictive markers of clinical outcome in vertically HIV-1 infected infants. A prospective longitudinal study. Pediatr Res 2000; 47:509-515.
3. Harada S, Koyanagi Y, Yamamoto N. Infection of HTLV-III/LAV in HTLV-I-carrying cells MT-2 and MT-4 and application in a plaque assay. Science 1985:563.
4. Poveda E, Briz V, Quinones-Mateu M, Soriano V. HIV tropism: diagnostic tools and implications for disease progression and treatment with entry inhibitors. AIDS 2006; 20:1359-67.
5. Swenson LC, Mo T, Dong WW, et al. Deep sequencing to infer HIV-1 co-receptor usage: application to three clinical trials of maraviroc in treatment-experienced patients. The Journal of infectious diseases 2011; 203:237-45.
6. Saliou A, Delobel P, Dubois M, et al. Concordance between two phenotypic assays and ultradeep pyrosequencing for determining HIV-1 tropism. Antimicrobial agents and chemotherapy 2011; 55:2831-6.
7. Daumer M, Kaiser R, Klein R, Lengauer T, Thiele B, Thielen A. Genotypic tropism testing by massively parallel sequencing: qualitative and quantitative analysis. BMC medical informatics and decision making 2011; 11:30.
8. Vandekerckhove L, Verhofstede C, Demecheleer E, et al. Comparison of phenotypic and genotypic tropism determination in triple-class-experienced HIV patients eligible for maraviroc treatment. The Journal of antimicrobial chemotherapy 2011; 66:265-72.
9. Svicher V, D’Arrigo R, Alteri C, et al. Performance of genotypic tropism testing in clinical practice using the enhanced sensitivity version of Trofile as reference assay: results from the OSCAR Study Group. The new microbiologica 2010; 33:195-206.
10. Ragupathy V, Zhao J, Wang X, et al. Comparative analysis of cell culture and prediction algorithms for phenotyping of genetically diverse HIV-1 strains from Cameroon. AIDS research and therapy 2009; 6:27.
11. Perez-Olmeda M, Poveda E. [Methods for determining viral tropism: genotype and phenotype tests]. Enfermedades infecciosas y microbiologia clinica 2008; 26 Suppl 11:40-8.
12. Low AJ, Swenson LC, Harrigan PR. HIV coreceptor phenotyping in the clinical setting. AIDS reviews 2008; 10:143-51.
13. Genebat M, Ruiz-Mateos E, Gonzalez-Serna A, et al. Discordance rates between Trofile test and short-term virological response to maraviroc. Antiviral research 2011; 89:182-5.
14. Gonzalez-Serna A, Leal M, Genebat M, et al. TROCAI (tropism coreceptor assay information): a new phenotypic tropism test and its correlation with Trofile enhanced sensitivity and genotypic approaches. Journal of clinical microbiology 2010; 48:4453-8.