Microscopio confocal

1. Introducción.

En un microscopio de fluorescencia convencional (p.ej., de campo amplio), el espécimen entero está sobresaturado de luz a partir de la fuente de iluminación. En la «epi-iluminación» del microscopio óptico convencional, la iluminación simultánea de todo el campo de visión en una pieza producirá siempre reflexión de luz en todo el espesor de la misma además de en el plano de enfoque.

Debido a la conservación de la intensidad de la luz en su recorrido, todas las partes del espécimen a lo largo de su ruta óptica serán excitadas y la fluorescencia detectada por un fotodetector o una cámara. Gran parte de la luz recogida por las lentes del objetivo para formar la imagen procederá de las regiones superiores e inferiores al plano focal seleccionado, contribuyendo al emborronamiento de la imagen final y degradándola de forma importante al reducir su contraste y definición de las formas.

Pero se sabe que casi toda la luz que emana de las zonas superior e inferior al plano de enfoque puede ser eliminada físicamente restringiendo la iluminación de la pieza a un solo punto. Para ello basta con introducir en el sistema óptico una apertura de imagen confocal y para obtener una imagen completa que contendrá únicamente la información del tejido «en foco».

En un sistema de imagen confocal, la zona de iluminación y la de detección están siempre confinadas en un mismo punto del espécimen en cualquier momento. Sólo la luz que está dentro de este plano puede ser detectada, de modo que la calidad de imagen es mucho mejor que las de campo amplio.

El microscopio confocal, es un microscopio óptico que incorpora dos diafragmas; uno de iluminación localizado tras la fuente luminosa denominado Pinhole de Excitación, cuya utilidad es eliminar la luz proveniente de planos superiores e inferiores al plano focal, aumentando con ello la claridad y resolución de la imagen; y otro de detección, de tamaño variable situado delante del fotodetector, denominado Pinhole de Emisión. El microscopio confocal incrementa el contraste y/o reconstruir imágenes tridimensionales utilizando un «pinhole» espacial (colimador de orificio delimitante) para eliminar la luz desenfocada o destellos de la lente en especímenes que son más gruesos que el plano focal.

La propiedad fundamental y distintiva de la imagen confocal es que sólo lo que está enfocado es detectado. Las áreas de la muestra fuera de foco aparecen negras, y no contribuyen a la formación de la imagen. Puesto que sólo se ilumina un punto cada vez en el microscopio confocal, se requiere una exploración (scanning) sobre un raster regular en el espécimen para obtener imágenes bi o tridimensionales. La delgadez del plano focal se define mayormente como el cuadrado de la apertura numérica de la lente del objetivo y también por las propiedades ópticas del espécimen y el índice de refracción del ambiente.

Si el punto es tan pequeño que sus límites están impuestos por la difracción, la resolución conseguida en este caso es mayor que la obtenida en un sistema convencional. La resolución lateral puede acercarse al máximo teórico incrementando 0.7 veces la resolución convencional.

2. El Microscopio confocal láser de barrido.

Fue inventado a mediado de 1950 por Marvin Lee Minsky pero no fue hasta 1987 cuando se comercializó por primera vez, y se desarrolló durante los años ’90 debido al avance en óptica y en electrónica.

En este tipo de microscopio la fuente de luz es un láser que ilumina el preparado a diferentes alturas, generando secciones ópticas de 0.5 a 1.5 micras de especimenes fluorescentes de un espesor de aproximadamente 50 micras o más. El laser permite una fuente de luz estable, uniforme y de una longitud de onda determinada. Esto es, a su vez, la principal limitación, ya que, no permite trabajar con todo tipo de fluorocromos, sino solo con aquellos que son capaces de excitarse a la longitud de onda del láser. Otra limitación impuesta por los láseres es el precio, ya que láseres potentes necesarios para trabajar con excitación ultravioleta son caros y, generalmente, refrigerados por agua. El importante desarrollo de láseres de estado sólido de baja potencia, permitirá en un futuro próximo, eliminar estas limitaciones.

El funcionamiento del microscopio láser confocal es muy similar al del microscopio de epifluorescencia pero el láser permite regular la intensidad de la luz, reduciendo así la pérdida de fluorescencia por «fluorescence fading», que consiste en la pérdida de fluorescencia del fluoruro por fotooxidación. Su principal ventaja es que permite obtener imágenes de mayor calidad mediante técnicas de filtrado espacial que eliminan la luz que proviene de planos fuera de foco. Esto permite controlar la profundidad de campo y, además, obtener series de imágenes del espécimen cambiando el plano de foco.

Uno de los más utilizados es el epi-iluminación, que utiliza la misma lente como condensador y objetivo, obviando la necesidad de ajustar y co-orientar dos lentes. La luz proveniente de la apertura es reflejada en la zona posterior de la lente objetivo y enfocada en la muestra. La luz que retorna desde la muestra, como resultado de la refracción o de la fluorescencia, vuelve a pasar a través de la lente y dirigida hacia una segunda apertura, lo cual permite que una porción de haz de luz pasar a un detector tal como un fotomultiplicador.

Como es comprensible, un sistema de imagen confocal no produce una imagen óptica completa del espécimen. Para obtener una imagen completa es necesario que el punto de detección sea “pasado”, o que barra, la superficie del campo de visión. Esto puede ser realizado haciendo pasar el espécimen a través del haz de luz (Barrido de la muestra), o haciendo pasar el haz de luz sobre la muestra fija (Barrido del haz). La imagen es generada electrónicamente a partir de las señales seriadas provenientes de los fotomultiplicadores.

3. Funcionamiento del equipo

Este microscopio consigue elevada resolución por tres procesos fundamentales:

– Primero se enfoca la luz mediante un lente objetivo, creando un haz biconico cuyo vértice o foco ilumina una zona de la muestra a la profundidad deseada.

– Luego la luz reflejada por esta área es enfocada y concentrada en un punto, permitiéndole que pase en su totalidad a través de una abertura confocal que es captada por un dispositivo detector como una vídeo cámara.

– Por último la luz es trasladada de una zona a otra hasta explorar el plano por completo.

Este barrido se obtiene por reflexión del haz luminosos en un espejo oscilante situado entre el espejo dicronico y las lentes del objetivo de tal forma que el punto luminosos y el diafragma confocal del detector permanezcan en registro. Se utilizan microscopios con un rayo de luz en X-axis con un espejo de Polygon y en el Y-axis un espejo de galvanometer-driven, con un ion láser de argón que opera a 488 nm para lograr excitar la fuente luminosa.

Además se obtienen imágenes detalladas de secciones del interior de una estructura intacta. El microscopio confocal posee un sistema de lentes ( NA 1.3 ) que pueden ser de forma circular con una resolución de 1/1.4 o anular con una resolución de 1/1.75, obteniendo series de secciones ópticas a diferentes profundidades del espécimen archivadas en un ordenador para reconstruir la imagen tridimensional.

A la hora de adquirir imágenes con el microscopio confocal deberemos de ajustar los siguientes parámetros:

– Línea de excitación e intensidad del láser. Normalmente un microscopio confocal viene con varios láser que tienen una o varias líneas de emisión: Argon (458, 476, 488, 496 y 514nm), Helio-Neón (543nm), Helio-Neón (633nm), Diodo azul (405 nm), etc. Un filtro óptico acústico (AOTF) permite seleccionar la línea o líneas de emisión que mejor se ajusten al espectro de excitación de los fluorocromos que tenemos en la muestra. Este filtro permite también regular la intensidad del láser. A mayor intensidad del láser tendremos mayor emisión de fluorescencia, pero también se nos producirá un mayor photobleaching (disminución de la fluorescencia con el tiempo).

– Apertura del pinhole (diafragma) de detección. Para cada objetivo existe una apertura óptima del diafragma de detección conocida como Airy 1 en la que el espesor de la sección que se obtiene es el mínimo lo que garantiza la máxima resolución en el eje Z. Cuando la intensidad de la fluorescencia es baja es posible que necesitemos aumentar la apertura de este diafragma para recoger más señal. En este caso estaremos aumentando el espesor de la sección y perdiendo resolución en Z.

– Ganancia del fotomultiplicador. Ajusta la amplificación de la señal eléctrica generada a partir de los fotones emitidos por la muestra. Si la intensidad de luz emitida por la muestra es débil deberemos de aumentar la ganancia para poder obtener la imagen. Un aumento excesivo de la ganancia se traduce en una pérdida de calidad de la imagen debido al ruido electrónico que se genera.

– Velocidad de barrido del láser. Se define como el número de líneas por segundo que barre el láser. A menor velocidad de barrido mejor relación señal/ruido y por tanto más calidad de imagen.

– Tamaño de la imagen. Define el número de píxeles que tendrá la imagen. Cuanto mayor sea el tamaño de la imagen para un campo determinado mejor será la resolución de la imagen.

En la práctica, el microscopio láser confocal es un módulo que se anexa al microscopio de epifluorescencia. El módulo confocal dispone de varias entradas que permiten excitar la muestra con láseres de distintas longitudes de onda, de acuerdo al fluoróforo que se utiliza. En general consta de 3 canales que pueden ser excitados de forma simultánea o secuencial, es decir que se enciende un láser por vez, se adquiere la imagen, se apaga el láser y se enciende el siguiente. Para escanear la superficie en el plano X-Y se utilizan dos espejos «Galvano Scanning Mirrors». La luz emitida por la muestra pasa por el espejo dicromático y luego es separada por canales, donde cada fotorreceptor recibe un canal.

Las aplicaciones de la microscopía confocal son las mismas que las de la microscopía de fluorescencia o la de campo claro o la de contraste de fases, con las ventajas del aumento de resolución y la capacidad de aumentar los contrastes sin disminuir la resolución.

El microscopio óptico convencional nos da imágenes degradadas y borrosas por la información que queda fuera del foco de las zonas de la muestra situadas encima y debajo del plano focal. El microscopio confocal, gracias a que utiliza los métodos electrónicos anteriormente enunciados permite enfocar un plano escogido de una muestra fina, eliminando la luz que proviene de las zonas fuera de foco superiores o inferiores a este plano. En la figura siguiente aparece una comparación de imágenes obtenidas con microscopio de epifluorescencia (a) (c) (e) y las mismas muestras utilizando microscopio confocal (b) (d) (f) respectivamente. Se aprecia claramente cómo se elimina la fluorescencia que está fuera del plano de foco.

4. Utilidades.

Este tipo de técnica sirve para estudiar la estructura de materiales biológicos, siendo muy útil en investigación biomédica. Permite:

– Monitorizar los movimientos de las moléculas dentro de las células. Por ejemplo el movimiento del Calcio.

– Localizar anticuerpos para estudios de inmunocitoquímica con mayor resolución que la microscopía convencional, realizar hibridación histoquímica in situ de alta resolución con procedimientos no isotópicos para localizar la posición de las secuencias de los ácidos nucleicos en las células.

– Trabajar con varias fluorescencias a la vez, dependiendo del número de fotomultiplicadores que posea el sistema.

– Trabajar con imágenes electrónicas en 3D o, dependiendo del programa, realizar estudios de análisis de imagen como los procesos de secreción en células vivas con marcadores como el FM1-43 (/). Con el uso de software y posterior al procesamiento de la imagen permite realizar colecciones de secuencias seriadas, reconstrucciones en 3D, medidas de colocalización de marcadores, imágenes laterales del objeto, superposición de imágenes obtenidas por diferentes técnicas. Además, brinda una alta calidad en tercera dimensión permitiendo realizar perfiles de superficie, medir profundidades y definir parámetros.

– Realizar seccionamientos ópticos, es decir que para observar los tejidos en sus diferentes niveles no es necesario dañar el tejido con seccionamientos reales.

– Una alta claridad en las imágenes, por lo cual existe la posibilidad de tener un alto grado de diferenciación.

El sistema de barrido punto a punto (scan) utilizado en los microscopios confocales de tipo CLSM comporta una serie de ventajas adicionales como son:

– Posibilidad de obtener imágenes perpendiculares al plano XY tomando la misma línea a diferentes profundidades.

– Fijar el láser sobre un punto o una pequeña zona de la muestra y tomar imágenes a diferentes tiempos para observar los efectos del láser sobre esa zona.

– Aumentar la resolución mediante zoom del área a barrer tomando mayor número de puntos en áreas más pequeñas.

5. Fluorocromos

Los fluorocromos son sustancias que tienen la propiedad de emitir un fotón de una longitud de onda determinada cuando captan (son exitados) por un fotón incidente de una longitud de onda característica.

Uno de los problemas de la utilización de fluorocromos en microscopía de fluorescencia es la pérdida de ésta debido a las grandes intensidades de luz empleadas. Las muestras empleadas en esta técnica no pueden observadas durante largos periodos de tiempo debido a la desaparición de la fluorescencia (‘fluorescence fading’). Se han desarrollado métodos que permiten reducir este efecto, entre ellos destacan :

• el uso de reactivos protectores de la fluorescencia (‘antifading reagents’)
• el uso de fluorocromos con poco ‘fading’
• el empleo de luz de excitación de menor intensidad
• la reducción de la concentración de oxígeno en el especimen
• el direccionamiento del 100% de la luz hacia el dispositivo de registro (cámara, película,…) para reducir al máximo el tiempo de exposición.
• el empleo de mecanismos de medición de la exposición óptima (automática) para reducir la iluminación al máximo.

Los reactivos ‘antifading’ son moléculas que aportan al fluorocromo aquellos electrones que ha perdido por la emisión fluorescente. Se trata de moléculas donadoras de electrones que deben encontrarse para ser efectivas en estrecha vecindad a las moléculas de fluorocromo.

Los reactivos antifading más empleados son los siguientes:

• p-phenylenediamine. Es el reactivo más efectivo para la conservación de la fluorescencia de la fluoresceína (FITC). También efectivo para la rodamina. Se emplea al 0.1% en glicerol/PBS. El reactivo se tiñe de blanco cuando se expone a la luz. Se ha de conservar en la oscuridad. El contacto con la piel es extremadamente peligroso.
• DABCO (1,4-diazabiccyclo-2,2,2-octane). Muy efectivo para la fluoresceína, aunque menor que la p-phenylenediamine. Es menos sensible a la luz y es mucho menos tóxico.
• n-propyl galeate. Es el agente más efectivo para la rodamina, aunque también es efectivo para la fluoresceína. Se emplea al 0.1% en glicerol/PBS.
• 2- mercaptoethylamine. Se emplea para la observación de cromosomas y muestras de DNA teñinas con ioduro de propidio (PI), naranja de acridina (AO) o cromomysin A3. Se emplea al 0.1 mM en Tris-EDTA.

6. Aplicaciones en microbiología.

Una de las limitaciones de la microscopía confocal es el tamaño de los objetos que es capaz de visualizar. Mientras que es capaz de mostrar con todo detalle levaduras, algas y protozoos, las bacterias sólo son visualizadas en condiciones especiales de grandes aumentos ópticos y electrónicos, perdiendo resolución. A pesar de ello, se puede estudiar la condensación del cormosoma bacteriano o el número de los mismos, mediante el uso de fluorocromos que se unen al DNA.

Por lo tanto, utilizando los fluorocromos adecuados se pueden estudiar los parámetros deseados. Por ejemplo, con levaduras se puede estudiar la posición de las cicatrices de quitina, mediante primulina o calcofluor; se puede comprobar la situación de los filamentos de actina y de los microtúbulos; se pueden realizar cinéticas de activación mediante medida de la movilización del Ca intracelular, se pueden estudiar varios parámetros a la vez, como es la viabilidad, mediante IP y la cantidad de proteína mediante FITC, se pueden comprobar las variaciones morfológicas debidas a mutaciones específicas, etc.

Dentro del campo de la infección, la microscopía confocal ha demostrado ser una herramienta eficaz al visualizar los microorganismos dentro de las células huésped y la forma de interaccionar entre los dos organismos. En la actualidad se están llevando a cabo, interesantes experimentos en esta área.

7. Preparación de la Muestra.

La preparación de las muestras varía según los procedimientos y las estructuras que se deseen visualizar. Por ejemplo:

– Células HeLa se tienen en medio de cultivo y son fijadas con glutaraldehido y PBS (solución buffer de fosfatos) y MgSO4. Luego son lavadas con PBS y tratadas con boro hídrico, Triton X-100 en PBS. Se colocan luego los anticuerpos monoclonales de antitubulina y FITC y finalmente son montadas en glicerol, para ser observadas al microscopio confocal observando imágenes nítidas y detalladas de los microtubulos.

– Los huevos de Psammechinus miliaris fertilizados son colocados en glicerol al 40% y son colocados en laminas cubiertas con poli-L-lisina, luego fijadas con metanol y tratadas con anticuerpos antitubulina que diferencia los centros mitoticos periféricos.

– Las células de una línea celular de plasmacitoma son fijadas al 3.5% de formaldehído permeabilizado con saponina y tratado con anticuerpos purificados contra endoplasmina.

– Las glándulas salivares de Drosopila; se realiza disección de la larva y se colocan en buffer A y cromomicina A3 que es un fluorocromo especifico del DNA así se observa el núcleo.

– Los embriones de nematodos se colocan en láminas recubiertas con poli-L-lisina congeladas en hielo seco, fijados con metanol y luego tratados con anticuerpos antitubulina y FITC.

Sin embargo, la preparación de las muestras es igual a la utilizada para microscopía de fluorescencia convencional y/o citometría de flujo, en cuanto a los métodos de fijación y la tinción o marcaje. Es importante tener en cuenta algunos aspectos:

a) Fijación. Cuando es necesaria se deben respetar los lugares de reconocimiento del anticuerpo y minimizar la presencia de artefactos. En general no son adecuados los fijadores como el glutaraldehído, porque exageran la autofluorescencia de la muestra, y son adecuados el paraformaldehído (4% en solución salina isotónica) y metanol o acetona fríos (-20°C).

b) Secciones Histológicas. El grosor depende de la distancia de trabajo propia de cada objetivo, de la penetrabilidad del anticuerpo o de los fluorocromos empleados en la tinción y de las propiedades de transparencia de los tejidos que conforman la muestra.

c) Atenuación de la fluorescencia. Se debe limitar el tiempo de observación, puesto que los radicales libres que se producen durante el tiempo de excitación de los fluorocromos dañan las células y los tejidos no fijados.

d) Conservación de las muestras. Deben ser protegidas de la luz, analizadas rápidamente y almacenadas en frío.

8. Precauciones

Es necesario tener en cuenta todas las normas de bioseguridad existentes para el manejo de materiales y sustancias en el laboratorio. Además es necesario garantizar un medio de trabajo seguro, es decir, que el piso sea el adecuado y este adecuadamente aseado, que los materiales de trabajo se encuentren en orden y adecuadamente marcados, contar con todos los elementos de protección personal necesarios para el laboratorio (guantes, tapabocas, gorro, bata).

Adicionalmente es importante que las personas que trabajan en el laboratorio tengan consciencia de los riesgos a los que están expuestos, con el fin de evitar al máximo las conductas inadecuadas que puedan predisponer a la presentación de accidentes. Es primordial que cada quien conozca las practicas y las técnicas de manipulación, es decir, que cada quien sepa con exactitud que va a hacer al interior del laboratorio.

 

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