Genómica: implicación de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) en la hepatitis C

Un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) es una variación de una base por otra en un lugar específico del genoma y, por definición, se encuentra en más de un 1 % de la población [1]. Son la forma más común de variación genética, con más de nueve millones reportados en las bases de datos públicas [2].

Con el Proyecto Genoma Humano iniciado en 1990 se determinó la secuencia que compone el ADN y se identificaron los aproximadamente 20000-25000 genes del genoma humano. Posteriormente, en el año 2002, surgió el proyecto HapMap con el objetivo fundamental de examinar el genoma en relación con los fenotipos y desarrollar investigaciones sobre genes y variaciones genéticas que afectan a la salud y la enfermedad. Debido a que se incluyeron sólo las variantes comunes, mucha información genética ha sido ignorada, especialmente SNPs de baja frecuencia que son la mayor parte de las variaciones genéticas [3]. Por tanto, estas herramientas pueden ser incompletas y no representativas de la población que nos interesa conocer. Algunos estudios han centrado su atención en evaluar el rendimiento de los SNPs derivados del HapMap y apoyan el uso de los datos del proyecto en otras poblaciones si se tiene en cuenta la densidad de SNPs y el sesgo hacia SNPs de alta frecuencia [4, 5].

1.- Características de SNPs

Los SNPs forman hasta el 90% de todas las variaciones genómicas humanas, y aparecen aproximadamente cada 300 bases, a lo largo del genoma humano. Cada una de las formas de un gen o marcador como un SNP se denomina alelo y estos diferentes alelos producen variaciones en las características hereditarias. En principio, no alteran el fenotipo de un individuo pero en determinadas condiciones ambientales pueden afectar a la función génica. Los SNPs genotipados en estudios de asociación se denominan tagSNP.

Los SNPs pueden encontrarse en regiones codificantes pudiendo alterar la estructura de la proteína y por tanto, su función, contribuyendo al desarrollo de una enfermedad o a cambios en la respuesta a determinados medicamentos. También los SNPs pueden encontrarse en regiones no codificantes, las cuales están conservadas a través de las especies y pueden representar regiones reguladoras funcionalmente importantes. También pueden ser útiles en estudios comparativos o de evolución [3].

2.- Estudios de asociación genética

Los estudios de asociación genética buscan establecer la relación estadística entre variables genéticas poblacionales y un fenotipo determinado (riesgo de enfermedad, respuesta a un determinado tratamiento, etc.). Estos estudios se están utilizando para descubrir el componente genético que subyace a las enfermedades comunes complejas y, en ellos, se establece el peso relativo del componente genómico con respecto a otros factores como el ambiente, sobre el riesgo de desarrollar la enfermedad [6]. Habitualmente los SNPs se utilizan por tanto como marcadores genéticos. Estas variaciones pueden ser en sí mismas funcionales y estar relacionadas con la fisiopatología de la enfermedad. Los dos acercamientos posibles son el del “gen candidato” cuando existe evidencia previa de la funcionalidad de la variante, o el de “asociación indirecta” que consiste en evaluar un mapa denso de SNPs para la asociación. También existen estudios denominados de ligamiento (linkage) que genotipan una serie de polimorfismos repartidos por todo el genoma en familias grandes con varios miembros afectados y sus análisis permiten identificar zonas del genoma de interés pero tienen poca resolución. Actualmente, la técnica de asociación genómica amplia (GWA, wide genome association) está siendo utilizada para la realización de un cribado del genoma completo con el fin de establecer posibles sitios de asociación. Los estudios de GWA genotipan miles de SNPs marcadores para estudiar las bases genéticas de las enfermedades complejas, validan los SNPs más significativos por genotipado en nuevas cohortes y realizan un mapeo fino de los SNPs adyacentes a los validados.

Cuando se planea un estudio de asociación genética, se consideran 4 componentes principales: el rasgo a ser estudiado (punto final de estudio), el grupo de individuos en el cual el rasgo va a ser medido (diseño propiamente dicho), los marcadores genéticos que van a ser genotipados y, por último, el método estadístico para evaluar la asociación entre el genotipo y el fenotipo. Las técnicas estadísticas y bioinformáticas desarrolladas han evolucionado extraordinariamente en los últimos años. La regresión logística es el método clásico para la combinación lineal de varios genotipos y su interacción [7] pero cuando el número de SNPs seleccionado es elevado, estos métodos requieren la enumeración de varios términos de interacción que dificultan su interpretación y aplicación. En estos casos, la alternativa es un modelo computacional más complejo que soporte mayor número de interacciones [8, 9]. Los estudios de asociación genética de rasgos complejos a menudo son mal interpretados y pobremente reproducibles [10].

3.- Aplicaciones de SNPs en relación con la hepatitis C crónica

Los factores genéticos heredables influyen en el riesgo de desarrollo o curso clínico de una variedad de enfermedades y pueden afectar a la respuesta al tratamiento. En el caso de hepatitis C crónica, gran cantidad de publicaciones han sugerido que un número de polimorfismos genéticos pueden influir en la progresión de la infección de hepatitis C crónica o en la respuesta de pacientes a la terapia antiviral [11].

3.1.- SNPs y su valor pronóstico en la progresión de la hepatitis C crónica

En la infección por el VHC, algunos pacientes presentan una mínima progresión de la enfermedad mientras que otros desarrollan un estado de enfermedad hepática grave caracterizada por niveles altos y persistentes de transaminasas, fibrosis hepática, cirrosis y CHC. Muchas investigaciones se están encaminando a la búsqueda de factores del huésped que puedan predecir el curso de la enfermedad. Existen muchas características como la edad, el sexo masculino y el consumo de alcohol que ya se sabe que son factores de riesgo asociados con la progresión de enfermedad hepática. Sin embargo, incluso para pacientes de la misma edad, sexo y similar consumo de alcohol existen diferentes estilos de progresión de enfermedad. Por ello, es interesante proceder al estudio de factores genéticos del huésped para determinar si polimorfismos específicos están asociados con la progresión de la hepatitis C [12] y poder saber de antemano qué pacientes son los que probablemente desarrollarán la enfermedad hepática. Esto permitiría un uso más racional de la terapia, y potencialmente ayudaría a la identificación de nuevas dianas terapéuticas.

Hasta la fecha, se han realizado numerosos estudios para examinar una amplia variedad de genes candidatos en la progresión de la enfermedad hepática y, aunque se han identificado algunas asociaciones importantes, los resultados son difíciles de interpretar por la ausencia de significado biológico en algunos casos [13]. Debido a la importancia que tiene el efecto del sistema inmune en el resultado de la infección por el VHC, se ha estudiado profusamente el efecto de polimorfismos presentes en el CMH en la progresión de la enfermedad. Uno de los hallazgos más significativos ha sido la asociación de haplotipos de DRB1 con niveles más bajos de ALT y con un curso de enfermedad más leve [14, 15]. Numerosos polimorfismos en genes de citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento se han relacionado con la replicación del VHC, la persistencia de la infección por el VHC, la gravedad de la enfermedad y el daño hepático. Valgan como ejemplos los polimorfismos en IL-2, IFN-gamma, IL-10 y TNF-alfa [16, 17]. También, se ha estudiado la relación de polimorfismos en diferentes componentes de la ruta del IFN con la progresión de la enfermedad [18].

3.2.- Farmacogenómica: SNPs como predictores de la respuesta al tratamiento en la hepatitis C crónica

La infección crónica por el VHC es un gran problema tanto a nivel mundial como a nivel del paciente individualizado. Parte del problema se relaciona con el hecho de que el tratamiento actual del VHC es caro, se encuentra asociado a importantes efectos secundarios y la respuesta virológica sostenida se limita a un bajo porcentaje de pacientes. Por ello, sería muy útil predecir la probabilidad de respuesta al tratamiento antes de iniciar el mismo (o poco tiempo después) ya que esto podría orientar la decisión terapeútica. Actualmente, las herramientas disponibles para la predicción de la respuesta al tratamiento están basadas en las características clínicas y serológicas, pero no se dispone de indicadores clínicos que aseguren la eficacia real de estas terapias a largo plazo. La identificación de genes de susceptibilidad permite una mejor comprensión de los mecanismos de los procesos de las enfermedades y facilita el descubrimiento de nuevos y más eficaces medicamentos. Los mapas de SNPs de todo el genoma también permiten la creación de perfiles de SNPs abreviados para ser utilizados en aplicaciones farmacogenéticas, permitiendo a los clínicos adaptar los regímenes terapéuticos (por ejemplo, identificar los pacientes susceptibles de recibir un beneficio terapéutico y no sufrir reacciones adversas) [19, 20].

Una gran cantidad de los trabajos recientemente publicados examinan la capacidad de diferentes SNPs para predecir la respuesta al tratamiento. La mayoría de ellos estudian polimorfismos presentes en CMH, citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento y otros componentes que participan en rutas de inmunidad innata y adaptativa [21-23].

3.2.1.- SNPs en el gen OASL como predictores de respuesta al tratamiento

La familia de proteínas OAS contiene OAS1, OAS2, OAS3 y OASL. El 2’-5’ oligoadenilato sintetasa (2-5 OAS) es inducido por el IFN y juega un papel antiviral clave por su actividad catalítica en el aclaramiento viral. OASL es reconocido como una molécula importante en la respuesta antiviral.

– Genes estimulados por el IFN y familia de genes OAS

La unión de IFN-alfa/IFN-beta e IFN-gamma a sus receptores lleva a la formación de factor génico 3 estimulado por IFN (ISGF3), una proteína que activa la transcripción del gen STAT1 e induce la formación de heterodímeros entre STAT1, STAT2 y p48 (o homodímeros de STAT1) respectivamente. Estos complejos homodiméricos se traslocan al núcleo y producen una regulación transcripcional de los miembros de la familia OAS, de la proteína quinasa dependiente de dsARN (PKR) y de la proteína MxA entre otras [24, 25]. La enzima 2’-5’ oligoadenilato sintetasa (2-5 OAS) fue una de las primeras proteínas antivirales caracterizada. Es producida como una enzima latente en las células estimuladas con IFN y su actividad enzimática es inducida por unión al dsARN proveniente principalmente de la replicación viral. El complejo activo OAS-ARN convierte ATP en PPi llevando a la formación de 2’-5’ oligoadenilatos (2-5A). 2-5A se une a una endorribonucleasa latente, RNasa L, desencadenando la formación de la enzima dimérica RNasa L activa la cual degrada dsARN (figura 8). Por lo tanto, el sistema 2-5 A constituye una ruta regulada y activada en respuesta a la infección viral disminuyendo la producción de proteínas virales [26].

Las proteínas OAS pertenecen a una familia altamente conservada, y no guardan homología de secuencia con otras proteínas. OAS1, OAS2, OAS3 presentan 1, 2 y 3 repeticiones de la unidad basal OAS. OASL por su parte se compone de una unidad OAS y un dominio C-terminal homólogo a una repetición de ubiquitina en tándem [26]. OASL es una proteína con actividad antiviral frente a ARN de cadena simple actuando a través de mecanismos diferentes a otras proteínas OAS [27]. El gen de OASL produce una proteína que es capaz de unirse a dsARN pero que es enzimáticamente inactiva [28] porque no posee 2 de los 3 residuos de ácido aspártico en algunas cadenas beta que son importantes para su actividad catalítica y además, posee mutaciones en el asa P que participan en la unión al ATP. OASL interfiere con el sistema 2-5 A bloqueando la activación de otras OAS quizá por su unión a dsARN [29].

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Figura 8: Representación esquemática del sistema 2-5 A en la infección viral y su inducción por IFN. Jak, Janus quinasa; Tyk, tirosina quinasa; STAT, transductor de la señal y activador de la transcripción; ISGF-3, gen factor 3 estimulado por el IFN; dsARN, ARN de hebra doble; ssARN, ARN de hebra sencilla; PKR, proteína quinasa R; ADAR, adenosina deaminasa específica de ARN.

– Presencia de SNPs en el gen OASL y RVS

En un artículo publicado recientemente, Su y col. genotiparon 91 SNPs presentes en genes de rutas de señalización del IFN (IPGs) y en genes estimulados por el IFN (ISGs) en 374 pacientes y concluyeron que, de todos los SNPs estudiados, la presencia de los SNPs rs3213545, rs1169279 y rs2859398 se asocia con una RVS en pacientes infectados crónicamente por el VHC y tratados con terapias basadas en IFN. Estos datos fueron validados en una segunda cohorte [30]. Por el interés subyacente de esta publicación, en esta tesis doctoral hemos centrado nuestra atención en el genotipado de estos 3 SNPs del gen OASL en pacientes pertenecientes a nuestra área geográfica.

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