MULTIPLICACIÓN DE LOS VIRUS ANIMALES
A. CÉLULAS HUÉSPED PARA LA MULTIPLICACIÓN.
Los primeros huéspedes usados fueron los animales adultos y embriones, para la experimentación en el laboratorio. Hoy han sido sustituidos por cultivos celulares.
B. CULTIVOS TISULARES.
1. EL CULTIVO PRIMARIO Y SECUNDARIO.
Se usan células de riñón de mono y células embrionarias de distintos animales. Las células se dividen hasta que forman una capa monocelular (inhibición por contacto). Este cultivo puede sobrevivir 2-3 semanas.
Después se puede tratar con tripsina y se separan las células. Estas células permiten iniciar un nuevo pase y conseguir un cultivo secundario.
2. LA CEPA CELULAR DE CÉLULAS DIPLOIDES.
Suelen ser fibroblastos que se obtienen después de 50-100 pases. Son células diploides más sensibles a las infecciones víricas. Ej: cepa WI-38 y MRC-5.
Las ventajas que presentan son:
– No llevan virus latentes, ni infecciones con micoplasmas.
– Se pueden usar para aislamiento de virus.
3. LÍNEA CELULAR.
Son células adaptadas a cultivos indefinidos, de aspecto epitelial y con una sensibilidad a la infección por virus limitada. Hay muchas lineas celulares adaptadas a virus que pueden proceder de células:
– Neoplásicas: HeLa, KB
– Renales de mono: Vero, LLC-MK2
– Hamster: BHK-21
– Conejo: RK-13
Para la producción de vacunas víricas se usan líneas celulares permanentes que son parecidas a las células malignas en su cultivo y aneuploidia. Estas células pueden tener virus latentes que:
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– Pueden ser una amenaza para la salud.
– Pueden producir interferencia viral con el virus de la vacuna.
4. CULTIVOS DE ÓRGANOS.
Se usan para virus que no se pueden cultivar en cultivos celulares como Rotavirus y Coranovirus
C. SENSIBILIDAD DEL HUESPED.
Cada virus animal puede duplicarse dentro de un cierto margen de células sensibles. Las células no sensibles proporcionan un bloqueo en un paso:
– Temprano: células resistentes que impiden la expresión del virus. Ej: Rc para la adhesión vírica.
– Tardío: células no permisivas que expresan algunas funciones víricas, pero no completa el ciclo vírico. Ej: ausencia de un factor para la transcripción del RNA vírico.
La infección con ácido nucleico desnudo rebasa la resistencia temprana, al no necesitar células con Rc.
D. INFECCIÓN COMO UNA FUNCIÓN DEL ÁCIDO NUCLEICO.
El ARN o ADN de la mayor parte de los virus animales es infeccioso y origina síntesis de viriones normales. Existen varias diferencias entre la infección por AN y viriones completos:
a) La eficacia de la infección del AN es mucho menor en un factor de un millón a 100 millones de veces. La infección aumenta en soluciones hipertónicas y presencia de polímeros básicos o con fosfato cálcico que son aditivos que protegen al AN frente a las nucleasas celulares y aumentan su captación por parte de la célula.
b) Los huéspedes posibles son muchos más en el caso del AN porque no necesitan Rc; pero solo se produce un ciclo de replicación vírica porque la progenie son viriones.
c) El AN infeccioso puede extraerse incluso de virus inactivados por el calor, y sigue siendo infeccioso.
d) La infecciosidad del AN no resulta afectada por los anticuerpos, pero si por las nucleasas presentes en los líquidos extracelulares.
PAPOVIRUS, ADENOVIRUS, HERPEXVIRUS, TOGAVIRUS y PICORNAVIRUS dan AN infeccioso. En los RETROVIRUS se puede obtener ADN vírico infeccioso.
PASOS DE LA INFECCIÓN VÍRICA
Penetra toda la nucleocápsida en la célula (bacteriofago no) y dentro es liberado el AN.
Las fases son:
– Unión o adsorción.
– Penetración.
– Perdida de la cubierta y eclipse.
– Período de síntesis.
– Maduración y liberación de virus.
A. UNIÓN O ADSORCIÓN A LA CÉLULA.
El virus puede ser recuperado en forma infecciosa sin necesidad de destruir la célula. La mayoría de los virus animales tiene moléculas de superficie para anclarse a Rc específicos de la célula huesped. Ej:
– VIH y CD4 de los linfocitos.
– VEB y CR2 en linfocitos B.
– VHB y Rc de albúmina en hapatocitos.
– Virus de la rabia y Rc nicotínico de las células musculares.
– Virus de la gripe y ac. siálico de las células epiteliales.
– Virus de la vacuna y el Rc del factor de crecimiento epidérmico.
B. PENETRACIÓN.
El virus ya no puede ser recuperado de las células intactas. Los virus
– Con envuelta: penetran cuando se fusionan con la membrana celular (citoplasmática o de las vacuolas cuando entran por fagocitosis).
– Desnudos: son captados por fagocitosis.
C. PERDIDA DE LA CUBIERTA Y ECLIPSE.
La eliminación de la cápsida libera al AN. El eclipse se pone de manifiesto cuando no podemos recuperar viriones infectantes después de haber destruido la célula, aunque se pueden recuperar AN infeccioso. En los virus:
– Encapsulados: el eclipse comienza cuando pierden la envuelta.
– Desnudos: cuando pierden la cápsida, la destrucción podría comienzar cuando se unen a los Rc de superficie celular.
Los Reovirus penetran en los lisosomas y aquí pierde la cápsida externa. También se puede producir en este período la actuación de las enzimas de replicación vírica.
D. PERÍODO DE SÍNTESIS.
1. TIPOS DE VIRUS.
1.1. VIRUS VIRULENTOS:
– Virus ADN: Adenovirus, Herpexvirus, virus de la vacuna.
– Virus ARN: Poliovirus, Reovirus.
Detienen la síntesis macromolecular de la célula, produciendo degradación de los polirribosomas de la célula y dando lugar al inicio de la síntesis vírica. En la mayoría de los virus este efecto no se produce en presencia de inhibidores de la síntesis proteica como puromicina y ciclohexamida, porque el proceso se halla mediado por proteínas de «novo» víricas del programa temprano.
Los efectos que aparecen en la célula son:
– El ADN celular puede ser degradado y aparecen roturas cromosómicas.
– La síntesis de ADN celular está inhibida sobre todo en la iniciación.
– La inhibición de la síntesis de ARN no afecta al ribosómico.
– La inhibición de la síntesis proteica es en la iniciación.
1.2. VIRUS MODERADOS (Polioma).
Pueden estimular la síntesis de ADN, ARNm y proteínas de la célula (carcinogénesis).
2. SÍNTESIS DE LOS VIRUS QUE CONTIENEN ADN.
El modelo que siguen es el de los bacteriofagos, pero con diferencias en su regulación. Existen tres clases de virus según el ADN:
– Tipo I (ADN doble lineal): ADENOVIRUS, HERPEXVIRUS, POXVIRUS.
– Tipo II ( ADN doble circular): PAPOVIRUS.
– Tipo III ( ADN de cadena única y lineal): PARVOVIRUS.
Las fases son:
a) TRANSCRIPCIÓN:
– La transcripción y traducción no están acopladas como en los bacteriofagos.
– Los ARNm primarios son más grandes que los que hay en los polirribosomas porque son procesados igual que el ARNm celular (proceso de maduración): eliminación de intrones, cadena poli A (3′), formación del Cap (5′). Estos procesos pueden realizarse en el núcleo o en el citoplasma por la célula huesped.
– Son ARN MONOCISTRÓNICOS como el celular. Los poxvirus son los únicos que sintetizan el ARNm primario en el virión y lo procesan proteínas víricas; los otros ARNm son procesados en el citoplasma. La síntesis de ARNm suele ser en el núcleo y luego van al citoplasma, donde forman polisomas por un proceso igual al celular.
– La transcripción es temporal, con ARNm tempranos y tardíos.
b) SÍNTESIS PROTEICA.
La síntesis de las proteínas capsidales se realiza en polisomas citoplasmáticos y las proteínas se dirigen al lugar de maduración. La síntesis de las glicoproteínas de la envuelta se realiza en el RER.
Los controles de la síntesis proteica son transcripcionales (a nivel de la transcripción del AN durante el ciclo vírico), menos en los herpexvirus, que siguen un modelo post-transcripcional (proteínas reguladoras que actuan en la traducción), cuyas proteínas se forman en sucesión.
c) REPLICACIÓN VÍRICA.
Utiliza precursores celulares derivados del medio, puesto que el ADN celular no esta degradado. La síntesis comienza a la mitad del período de eclipse. La replicación es semiconservativa generalmente, pero con peculiaridades:
– Adenovirus: replicación asimétrica.
– Herpexvirus: compleja.
– Poxvirus: llevan un polinucleotido corto que entrecruza la cadena doble
– Papovirus: bidireccional y simétrica, tienen enzima despiralizante.
– Parvovirus: ADN con repeticiones finales invertidas que se unen.
El ADN formado se une a proteínas y forman el virión. El ADN vírico se forma en exceso y gran parte queda sin utilizar en la célula infectada (bacteriofago no).
3. SÍNTESIS EN VIRUS ARN.
No pueden seguir el patrón de los fagos ARN, ya que en las células eucariotas la transcripción y la traducción están separadas en el tiempo y en el espacio.
Los ARN víricos no pueden funcionar como policistrónicos ya que la síntesis proteica eucariota no puede iniciarse de forma directa, pero sin embargo puede vencerse este obstáculo:
– El ARN vírico puede actuar como mensajero traducido como monocistrónicamente y dar un peptido gigante que después es procesado y da proteínas víricas. Ej: Picornavirus.
– El ARN vírico es transcrito para dar ARN monocistrónico. Ej: Paramixovirus.
– El genoma es una colección de fragmentos de ARN separadas que tienen que ser transcritos a ARNm monocistrónico. Ej: Ortomixovirus.
Los virus ARN animales se pueden clasificar en cinco grupos:
a) Tipo I (Picornavirus, Togavirus). ARN monocatenario positivo que actúa de mensajero. Sintetiza enzimas y proteínas estructurales.
b) Tipo II (Paramixovirus). ARN monocatenario de cadena negativa que no sirve de mensajero (antimensajero). Necesita de una transcriptasa vírica que va en el virión para que forme el ARNm correspondiente a cada gen.
c) Tipo III (Ortomixovirus). ARN monocatenario de cadena negativa y fragmentado en varias piezas no superpuesta. Cada fragmento codifica un gen y es transcrita de forma separada por una transcriptasa vírica. En los tipos I, II y III no hay diferencias entre ARNm temprano y tardío.
d) Tipo IV (Reovirus). ARN bicatenario de cadena doble y fragmentado en segmentos no superponibles. Cada uno de ellos es transcrito a un ARNm monocistrónico por una replicasa del virión.
e) Tipo V ( Retrovirus). Contienen dos segmentos de ARN de cadena positiva idénticos, unidos por puentes de hidrógeno a nivel del extremo 5′ (únicos virus diploides), y con polaridad de mensajeros (lleva en 3’un poli A y en 5’el Cap). En la infección productiva, el ARNm es transcrito a partir de ADN vírico insertado en el genoma celular (provirus) por medio de la RNA poli II celular.
La conclusión es que:
– Los virus ARN negativos llevan ARN polimerasa en el virión (transcriptasa).
– El ARN negativo no es infeccioso cuando se purifica y se separa de la transcriptasa.
– Los retrovirus se comportan de una manera aberrante, ya que son ARN positivos, pero necesitan formar ADN para ser efectivos.
Los mecanismos de replicación son:
a) Replicación del ARN de cadena única
– La actinomicina D bloquea la síntesis de ARN vírico.
– Los tipos I, II y III tienen un mecanismo similar a los fagos: se forma un intermedio replicante (IR) de cadena doble.
b) Replicación de virus RNA de cadena doble.
– Cada fragmento del ARN virico del Reovirus se replica de forma independiente, ya que cada uno de ellos lleva un NTP en 5′.
– La transcripción la lleva a cabo la transcriptasa del virión y en los núcleos de los viriones, formándose ARN de cadena positiva que actúa de mensajero y de molde para la síntesis de más ARN de cadena doble.
– La replicación es asimétrica y conservadora. Solo la cadena de ARN negativo inicial sirve de molde para el ARN positivo.
– Las cadenas de ARN negativo no se encuentran libres.
– Difiere de los ARN de cadena sencilla en:
– Es conservativa y asimétrica.
– No se produce a través de intermediarios de replicación IR.
– Solo se empaquetan en los viriones las formas ARN bicatenaria.
c) Replicación en Retrovirus.
– La replicación es bloqueada por dactinomicina o por un inhibidor de la síntesis de ADN añadido en la primera fase. Si el inhibidor de la replicación se añade tarde no se detiene la síntesis vírica de ADN, aunque sigue siendo sensible a la dactinomicina.
– La replicación tiene lugar con un IR de ADN circular de cadena doble que se forma a partir del ARN vírico por medio de una transcriptasa inversa. El ARN de cadena positiva para la descendencia se sintetiza a partir de ADN que esta insertado en el genoma celular.
– La transcriptasa inversa esta presente en los viriones y forma ADN. El RNAm lo sintetiza la RNA poli II a partir del provirus insertado; este RNAm actúa como monocistrónico y producen poliproteínas que después son segmentadas.
La síntesis de proteínas víricas:
Son sintetizadas de forma distinta según la naturaleza monocistrónica de su ARNm:
a) Cuando el virus tiene varios ARNm, cada uno codifica una proteína.
b) Cuando el genoma sirve de mensajero aislado (picornovirus), se forma una poliproteína gigante que después se desdobla (elaboración) en proteínas víricas por acción de proteasas que reconocen estructuras secundarias y terciarias.
Las enzimas que intervienen en la síntesis:
– La ARN polimerasa vírica aparece en virus de cadena única y es dependiente de RNA. Tiene dos funciones: transcripción y replicación.
– La transcriptasa se encuentran en viriones de tipo II y IV y sintetiza ARNm.
– La replicasa sintetiza cadenas de RNA de ambas polaridades.
La regulación de la síntesis proteica varia según la estructura de los ARN genómico:
– Tipo I: regulación postranscripcional.
– Tipo IV: regulación transcripcional y postranscripcional.
E. MADURACIÓN Y LIBERACIÓN DE VIRUS ANIMALES.
1. VIRUS ICOSAÉDRICOS DESNUDOS (ARN y ADN).
Consta de dos fases principales la maduración:
a) Acoplamiento de las proteínas víricas para formar la cápsida.
b) Unión de la cápsida a un AN.
En los virus ADN estas dos fases son totalmente independientes, ya que hay diferencias de varias horas. En los virus ARN la asociación de la cápsida con el AN se hace casi simultáneamente (30-60 minutos de diferencia).
Tanto en virus animales como en bacteriofagos, las cápsidas vacías producidas durante el proceso de replicación (procápsidas) son precursores de viriones. Después del acoplamiento, los viriones se acumulan en grandes cantidades en el punto de maduración, formando cristales intracelulares.
La liberación depende del virus y del tipo de célula. Los virus ARN se liberan por lisis.
2. VIRUS ENCAPSULADOS (ARN y ADN).
2.1. MADURACIÓN. Las proteínas víricas tienen que estar asociadas con el AN para formar la nucleocápsida, que después es rodeada por la cubierta.
Las proteínas capsidales son producidas por POLISOMAS y se ensamblan rápidamente por un proceso de autocatalisis en el:
– Núcleo: Paramixovirus.
– Citoplasma: Ortomixovirus.
El virus del sarampión es el único paramixovirus que madura en el núcleo y en el citoplasma.
2.2. ENSAMBLAJE DE LA CUBIERTA.
Las proteínas víricas se sitúan en la membrana celular, sustituyendo a las proteínas del huesped. Los lípidos prácticamente se mantienen y los H de C no varían. Los virus tendrán lípidos e H de C según la célula de origen.
Las glucoproteínas víricas son sintetizadas en el RER, mientras que todas las demás en polisomas libres. En el RER, el polipeptido, es insertado en la membrana y queda el extremo N-terminal hacia el lumen y después hacia el exterior de la célula.
– En este extremo N-terminal se produce la glicosilación por las enzimas de la membrana del huesped.
– El extremo C-terminal puede quedar en el lado del citoplasma o quedarse insertado en la membrana.
Cuando la cubierta vírica contiene una proteína matriz o proteína M, esta se sintetiza en los polisomas y se pega a la membrana por el lado citoplasmático, a los extremos C-terminal de las glicoproteínas de membrana.
2.3. FORMACIÓN Y LIBERACIÓN DE VIRIONES.
Por gemación de las membranas celulares y se puede dar una adhesión entre la proteína M y la nucleocápsida. La membrana se curva, dando lugar a una esfera que rodea a la nucleocápsida.
Los Togavirus no tienen la proteína M y la nucleocápsida se asocia directamente con las glicoproteínas. El brote puede partir de:
– Membrana celular en Paramixovirus (todos a la vez).
– RE y vacuolas en Togavirus, que se fusionan con la membrana plasmática.
– Membrana nuclear en los Herpexvirus.
Este mecanismo es compatible con la vida, y una célula puede producir un alto número de viriones.
2.4. ALTERACIONES DE LA SUPERFICIE CELULAR PRODUCIDAS POR LA MADURACIÓN VÍRICA: los componentes de la cubierta se incorporan a la membrana citoplasmática antes de la gemación y confiere a la célula propiedades del virión:
– Puede unirse a hematies: hemoadsorción o hemoaglutinación.
– Puede unirse a Ac antivíricos y hace que el sistema inmunológico reaccione contra la célula.
– Puede fusionarse a células no infectadas, produciendo sincítios multinucleados o policariocitos, que equivalen a la unión del virión y la célula. Los policariocitos pueden ser:
– Endógenos: virus latente que transforma la célula.
– Exógenos: infección productiva de virus.
3. VIRUS COMPLEJOS: POXVIRUS.
– La síntesis proteica tiene lugar en focos citoplasmáticos o factorías. Hay formación de membranas continuas bilaminares que rodean al viroplasma condensado.
– El ADN vírico parece entrar en partículas preformadas y dentro de la membrana completa crece un nucleoide inmaduro con ADN vírico.
– Se forma una membrana externa y otra externa que contiene lípidos de NOVO y de composición distinta a la de la célula.
F. ENSAMBLAJE DE SUBUNIDADES EN DEPOSITO DE PRECURSORES.
Los componentes se ensamblan al azar a partir de una reserva común. Ej: una célula que es infectada por dos virus que difieren en los Ag capsidales, como los poliovirus 1 y 2, originan una mezcla fenotípica.
INFECCIÓN ABORTIVA
Cuando algún paso de la replicación vírica es defectivo, el resultado es un ciclo único incompleto que no da virus infecciosos, aunque puede destruir la célula.
1. INFECCIÓN ABORTIVA DEPENDIENTE DE LA CÉLULA.
La no permisividad puede ser una característica celular o del tejido. Esto es debido a que falla el mecanismo del virus y el de la célula en su acoplamiento para producir viriones.
En Adenovirus y el SV40, se complementan para producir viriones y el SV40 actúa como auxiliador para producir ARN.
2. INFECCIÓN ABORTIVA DEPENDIENTE DE VIRUS.
Hay mutantes víricos defectivos que no tienen un fragmento de genoma y no son capaces de formar viriones, pero si es infectado por un virus normal a la vez, este actúa como auxiliador.
Los virus oncogénicos de ARN generan mutantes de delección que expresan algunas funciones víricas y transforman a la célula, pero no producen viriones en la progenie, salvo que halla un virus auxiliador.
Los virus ADN oncogénicos normales si pueden producir viriones.