Este artículo ha sido publicado en: García-Álvarez M, Berenguer J; Guzmán-Fulgencio M, Micheloud D, Catalán P, Muñoz-Fernandez MA, Álvarez E, Resino S. High plasma fractalkine (CX3CL1) levels are associated with severe liver disease in HIV/HCV co-infected patients with HCV genotype 1. Cytokine 2011; 54 (3): 244-248.
INTRODUCCIÓN
Las quimiocinas, citocinas quimiotácticas que atraen a los leucocitos a los sitios inflamatorios, orquestan la respuesta inmune frente a los virus, incluyendo al virus de la hepatitis C (VHC) [1]. Sin embargo, una persistencia inadecuada de la expresión de quimioquinas en la infección por el VHC puede conducir a daño tisular, inflamación intrahepática y lesión de las células del hígado [1]. Las quimiocinas están implicadas indirectamente en la fibrosis mediante el reclutamiento de células inflamatorias y las células estrelladas hepáticas (HSCs), las cuales desempeñan un papel central en la fibrogénesis [1, 2]. Este bucle inflamatorio es responsable de necroinflamación crónica y el desarrollo de la fibrosis y la cirrosis [1].
Los niveles de quimiocinas en sangre periférica (plasma o suero) se han asociado con la fibrosis en pacientes monoinfectados por VHC [1], y algunas quimiocinas (quimiocinas asociadas a CXCR3) son capaces de predecir la fibrosis en pacientes de raza blanca e infectados por el genotipo 1 del VHC [3]. El VHC de genotipo 1 se ha asociado con un mayor daño oxidativo, inflamación y activación del sistema inmune [4, 5]. Así, el genotipo del VHC podría ser otro factor limitante en la obtención de resultados significativos entre el nivel de las quimioquinas y el estadio de fibrosis.
La infección por el VIH afecta negativamente la historia natural de la infección por el VHC, resultando en mayores tasas de progresión de la fibrosis, cirrosis y enfermedad terminal del hígado que en pacientes monoinfectados por el VHC [6]. Además, el VIH utiliza la maquinaria celular del huésped para su replicación y supervivencia, conduciendo a la inducción de mediadores inflamatorios como las quimioquinas, que pueden apoyar o inhibir la replicación del VIH y podría desempeñar un papel central en la patología mediada por el VIH [7] . Por lo tanto, es posible que los datos obtenidos en pacientes monoinfectados por VHC no sean totalmente extrapolables a los pacientes coinfectados por VIH/VHC.
El objetivo de este trabajo fue estudiar la asociación de los niveles plasmáticos fractalquine (CX3CL1) con el estadio de fibrosis y el grado de actividad necroinflamatoria de las biopsias hepáticas en pacientes coinfectados por VIH/VHC y con VHC de genotipo 1.
Pacientes y métodos
Los pacientes
Se realizó un estudio transversal en 125 pacientes coinfectados por VIH/VHC y con VHC de genotipo 1 del Hospital General Universitario “Gregorio Marañón” de Madrid (España) que se sometieron a una biopsia hepática, ya que eran candidatos potenciales para la terapia frente al VHC.
Los criterios de inclusión fueron: no evidencia clínica de descompensación hepática, ARN del VHC detectable mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), HCV genotipo-1, antígeno de superficie B negativo, linfocitos CD4 + >=200 células/mm3, y terapia antirretroviral estable o no necesidad de terapia antirretroviral. Los criterios de exclusión fueron: infecciones oportunistas activas y la adicción a drogas activa.
De nuestra cohorte de 361 pacientes con biopsia de hígado, 205 pacientes tuvieron una muestra de plasma recogida y congelada, y sólo 125 de estos 205 fueron infectados con el VHC de genotipo 1. Los restante 80 pacientes estuvieron infectados por los siguientes genotipos: 2 (1%) VHC genotipo 2, 47 (22,9%) VHC genotipo 3, y 31 (15,1%) VHC genotipo 4. Estos pacientes fueron excluidos del estudio debido a que alcanzaron un tamaño suficiente de cada genotipo en cada una de los estadios de la escala METAVIR.
Todo el trabajo se realizó de conformidad con la Declaración de Helsinki. Todos los pacientes dieron su consentimiento por escrito para la biopsia del hígado y el Comité de Ética aprobó el estudio.
Datos clínicos y de laboratorio
Las biopsias de hígado se realizaron según lo descrito previamente [8]. La clasificación y estadiaje de las biopsias hepáticas se llevaron de acuerdo a la escala METAVIR [9].
En el día de la biopsia, la siguiente información se obtuvo de las historias clínicas: edad, sexo, riesgo categoría, peso, talla, consumo de alcohol, categoría CDC clínica, recuento de células CD4, terapia antirretroviral previa, el tratamiento antirretroviral en el momento de la biopsia hepática, el tiempo total de terapia antirretroviral, carga viral del VIH y VHC y genotipo del VHC.
En cada paciente, el grado de resistencia a la insulina se estimó por el método de evaluación del modelo homeostático (HOMA) mediante la fórmula: glucosa en plasma (mmol/L) x insulina en suero (mU/L)/22,5.
La concentración plasmática de fractalquina (CX3CL1) se midió utilizando LINCOplex TM kit ((LINCO Research, St. Charles, MO 63304, Estados Unidos) en un analizador Luminex 100 ™ (Luminex Corporation, Austin, Texas, Estados Unidos) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. CX3CL1 se detectó en el 100% de las muestras analizadas.
Estadística
Los datos categóricos y las proporciones se analizaron mediante el test de chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher cuando fue necesario.
La transformación logarítmica se llevó a cabo para todas las variables que no se distribuyeron normalmente. El análisis de varianza (ANOVA) fue utilizado para comparar las diferencias de medias entre dos o más grupos, ajustado por el test de Bonferroni.
También se realizó un análisis de regresión logística para evaluar la influencia de los niveles plasmáticos de fractalkina en la enfermedad hepática. Para los niveles plasmáticos de CX3CL1, se utilizaron puntos de corte cercanos percentil 75 (P75 , 1100 pg/mL). Este punto de corte separa el 25% de los pacientes con los valores más altos de CX3CL1: CX3CL1 <1.100 pg/ml (bajo CX3CL1) y CX3CL1 >=1100 pg/mL (alta CX3CL1).
Todas las pruebas fueron de dos colas y los valores de p <0.05 fueron considerados como significativos. El análisis estadístico se realizó mediante el programa informático SPSS 15.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, Estados Unidos).
RESULTADOS
Las características de los pacientes coinfectados VIH/VHC en el momento de la biopsia hepática se muestran en la Tabla 1. La edad media fue 39,3 años, 74,4% eran hombres y el 33,6% habían tenido previo diagnóstico de SIDA. Cuando la biopsia hepática fue realizada, el 92,8% de los pacientes estaban en tratamiento antirretroviral de gran actividad (TARGA). El recuento de CD4 + fue de 476 células/mm 3, el 72,8% tenían un ARN del VIH <50 copias/ml, y el 72,8% tenían un ARN-VHC> 500.000 UI/mL.
Tabla 1. Características de los 125 pacientes coinfectados VIH/VHC con VHC de genotipo 1 que se sometieron a una biopsia hepática.
| No. de pacientes * | 125 |
| Sexo (masculino) * | 93 (74.4) |
| Edad (años) # | 39,3 (36,3; 43,3) |
| VIH adquirida por ADVP * | 112 (89.6) |
| SIDA * | 42 (33.6) |
| Elevado consumo de alcohol * | 74 (59.2) |
| Terapia antirretroviral | |
| No tratados | 9 (7.2) |
| Basados en IP * | 33 (26.4) |
| Basados en NNRTI * | 59 (47.2) |
| Basados en 3 INTI * | 21 (16.8) |
| * Otros | 3 (2.4) |
| Fibrosis – Metavir * | |
| Sin fibrosis (F0) | 13 (10.4) |
| Fibrosis portal (F1) | 37 (29.6) |
| Fibrosis periportal (F2) | 35 (28) |
| Puentes de fibrosis (F3) | 27 (21.6) |
| Cirrosis (F4) | 13 (10.4) |
| Grado de Actividad – Metavir * | |
| Actividad leve (A1) | 52 (41.6) |
| Actividad moderada (A2) | 52 (41.6) |
| Actividad grave (A >=3) | 20 (16) |
| Resistencia a la insulina | |
| HOMA # | 2.6 (1.7, 3.9) |
| HOMA >= 3.8 * | 34 (27.2) |
| Marcadores VIH | |
| Nadir CD4 + # | 200 (98, 306) |
| CD4 + T-cells/microL # | 476 (352, 618) |
| CD4 + T-cells/microL <500 * | 68 (54.4) |
| Log 10 HIV-RNA (cp/mL) # | 0 (0, 1,7) |
| ARN del VIH <50 cp/mL * | 96 (76.8) |
| Marcadores VHC * | |
| ARN-VHC> 500.000 cp/ml | 91 (72.8) |
| Parámetros bioquímicos # | |
| AST (UI/L) | 54 (38, 85,7) |
| GGT (UI/L) | 107 (52, 200) |
| ALT (UI/L) | 74,5 (50; 117,7) |
| AST/ALT | 0,75 (0,6; 1) |
* Número absoluto (porcentaje) # Mediana (percentil 25, percentil 75). Abreviaturas: ALT: alanina aminotransferasa. AST: aspartato aminotransferasa. GGT: gamma glutamil transpeptidasa. VHC: virus de la hepatitis C. ARN-VHC: carga viral en plasma VHC. VIH-1: virus de inmunodeficiencia humana tipo 1. ARN-VIH: carga viral VIH en plasma. HOMA: método de evaluación del modelo homeostático. ADVP: usuarios de drogas intravenosas. NNRTI: no análogos de nucleósidos inhibidores de la transcriptasa inversa del VIH. INTI: análogos de nucleósidos inhibidores de la transcriptasa inversa del VIH. PI: inhibidor de la proteasa.
No se encontró ninguna correlación de los niveles plasmáticos de CX3CL1 y los parámetros bioquímicos de función hepática como razón normalizada internacional (INR), fosfatasa alcalina (ALP), aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), gamma-glutamil transferasa (GGT), albúmina, y el fibrinógeno.
La Figura 1 muestra la distribución de los niveles plasmáticos de CX3CL1 según el estadio de de fibrosis y el grado de actividad. Los pacientes con fibrosis avanzada (F >=3) y el grado de actividad grave (A >=3) tenían mayores niveles plasmáticos de CX3CL1 que aquellos con ausencia de fibrosis o fibrosis leve (F0/F1) (Figura 1) y el grado de actividad bajo (A0/A1) (Figura 1B), respectivamente.
Figura 1. Resumen de los niveles plasmáticos de CX3CL1 según el estadio de fibrosis (A) y el grado de actividad (B) de la biopsia hepática en 125 pacientes coinfectados por VIH/VHC y con VHC de genotipo 1. Las líneas horizontales dentro de cada caja representan la mediana, y los bordes superior e inferior de la caja, el rango intercuartil. Las líneas verticales de los extremos de cada caja, los puntos de datos extremos.
La Tabla 2 muestra la asociación los niveles plasmáticos de CX3CL1 con la escala METAVIR ajustados por características epidemiológicas, clínicas y virológicas. En concreto, los niveles plasmáticos de CX3CL1 se asociaron significativamente con mayores probabilidades de fibrosis significativa (F >=2), fibrosis avanzada (F >=3), y el grado de actividad necroinflamatoria moderada (A >=2). Este efecto no se encontró con A >=3.
También se encontró que 16 de los 35 (45,7%) pacientes con altos valores de CX3CL1 fueron F >=3 frente a 24 de los 90 (26,6%) pacientes con bajos valores de CX3CL1 que fueron F >=3 (p =0,032). Tomando los valores bajos de CX3CL1 como categoría de referencia, la odds ratio (OR) de tener F3-F4 se incrementó significativamente cuando había valores plasmáticos elevados de CX3CL1. Además, 25 de los 35 (71,4%) pacientes con valores alto de CX3CL1 fueron A >=2 frente a 48 de 90 (53,3%) pacientes con bajos valores de CX3CL1 que fueron A >=2 (p =0,050). Por lo tanto, valores elevados de CX3CL1 se asociaron significativamente con mayores probabilidades de tener A >=2 en la biopsia hepática.
Tabla 2. Asociación de los valores plasmáticos de fractalquina (CX3CL1) y la enfermedad hepática en 125 pacientes coinfectados por VIH/VHC y con genotipo 1 del VHC.
|
Fibrosis |
Grado de actividad |
Grado de actividad moderada (A >= 2) |
||||||||||
|
Significativo (F >= 2) |
Avanzado (F >= 3) |
Moderado (A >= 2) |
Grave (A >= 3) |
Fibrosis significativa (F >= 2) |
Fibrosis avanzado (F >=3) |
|||||||
|
OR (95% CI) |
p |
OR (95% CI) |
p |
OR (95% CI) |
p |
OR (95% CI) |
p |
OR (95% CI) |
p |
OR (95% CI) |
p |
|
| Log 10 fractalquina (pg/mL) |
3.47 (1,04; 11,58) |
0.042 |
6.78 (1,70; 26,93) |
0.007 |
4.09 (1,21; 13,87) |
0.024 |
3.13 (0,47; 20,51) |
0.234 |
5.49 (1,46; 20,58) |
0.011 |
8.99 (2,06; 39,23) |
0.003 |
| Fractalquina >= 1100 pg/mL |
2.40 (0,93; 6,14) |
0.068 |
2.67 (1,13; 6,40) |
0.028 |
2.71 (1,05; 7,01) |
0.039 |
2.88 (0,85; 9,71) |
0.087 |
2.31 (1,02; 5,28) |
0.046 |
3.02 (1,22; 7,48) |
0.017 |
Siglas: OR, odds ratio, 95% IC, intervalo de confianza del 95%, p-valor: nivel de significación estadística. La prueba estadística utilizada para obtener los valores de “p” fue una regresión logística multivariante ajustadoa por edad, sexo, nadir CD4 +, SIDA, consumo elevado de alcohol (>50 gramos de alcohol por día de >=12 meses), HOMA, células CD4 +/mm 3, carga viral del VIH y VHC.
Cuando se analizaron los estadios de fibrosis y grados de actividad en conjunto, se encontró una asociación positiva y significativa de los valores de CX3CL1 con A >=2/F >=2 y A >=2/F >=3 (Tabla 2). Así, 25 de los 35 (71,4%) pacientes con altos valores de CX3CL1 fueron F>=2/A >=2 frente a los 42 de 90 (46,6%) pacientes con bajos valores de CX3CL1 que fueron F >=2/ A >=2 (p = 0,010). Por lo tanto, el OR de tener F >=2/A >=2 aumentó significativamente con los valores elevados de CX3CL1 (Tabla 2). Además, 16 de los 35 (45,7%) pacientes con valores altos de CX3CL1 fueron F >=3 /A >=2 frente los a 22 de 90 (24,4%) pacientes con bajos valores de CX3CL1 que fueron F >=3/A >=2 (p =0,021). Por lo tanto, valores elevados de CX3CL1 se asociaron significativamente con mayores probabilidades de F >=3/A >=2 en la biopsia hepática (Tabla 2).
DISCUSIÓN
Nuestros datos proporcionan evidencia de una fuerte asociación entre los niveles plasmáticos de CX3CL1 con la enfermedad hepática severa en las biopsias hepáticas de pacientes coinfectados por VIH/VHC y con VHC de genotipo 1.
CX3CL1 existe en dos formas, una de membrana y otra forma soluble, que median funciones biológicas distintas. Asociada a la membrana, CX3CL1 provoca la adhesión de los leucocitos a las células endoteliales activadas y la migración de los leucocitos mediante la interacción con el receptor de quimiocinas CX3CR1, el único receptor conocido para CX3CL1 [10, 11]. CX3CR1 se expresa en el hígado, ayudando a la infiltración de células mononucleares (monocitos, células dendríticas mieloides, células asesinas naturales, y las células Th1), y puede ayudar a conservar estas células en los sitios de inflamación del epitelio o infección [1]. Las formas de CX3CL1 solubles pueden ser liberados por proteólisis en una región proximal por la enzima de conversión de TNF-alfa (TACE; ADAM17) y ADAM10 [12, 13], y esto se asemeja a una forma soluble de quimiocinas más convencional, que presenta actividad quimiotáctica eficiente para los monocitos, células NK y células T. Estas células que expresan CX3CR1 en la membrana celular migran de manera eficiente en la dirección de un gradiente positivo de CX3CL1 soluble [10]. Por lo tanto, parece razonable que la forma detectada en el plasma de los pacientes coinfectados por VIH/VHC de nuestro estudio sea la forma soluble.
Mientras CX3CL1 soluble puede tener múltiples orígenes, en las enfermedades del hígado, CX3CL1 se expresa y secreta en las HSCs, células endoteliales, las células endoteliales sinusoidales del hígado y células epiteliales de la vía biliar intrahepática [14, 15]. Las quimiocinas podrían permitir el reclutamiento de células inmune inflamatorias, haciendo el daño del hígado recurrente que puede contribuir al desarrollo de cirrosis y carcinoma hepatocelular [16]. Así, nosotros pensamos que la mayoría del CX3CL1 plasmático de nuestros pacientes puede venir del hígado debido a que los niveles plasmáticos de CX3CL1 se asociaron con estadios avanzados de la enfermedad hepática, y los niveles de CX3CL1 podrían reflejar el nivel de infiltración hepática de leucocitos que perpetúan la lesión hepática, sin efectiva limpieza el virus [1].
Los niveles plasmáticos elevados de CX3CL1 en nuestros pacientes con estadios avanzados de la enfermedad del hígado pueden indicar un mayor vínculo inflamatorio y una respuesta CX3CL1 activa que selectivamente recluta células inflamatorias en el hígado. Además, las señales proinflamatorias (lipopolisacárido (LPS), IL-1, TNF-alfa, IFN-gamma, y CD40L) indicen CX3CL1 en las células endoteliales, reclutando células inflamatorias y células Th1, y ampliando la polarización Th1 de la respuesta inflamatoria [17]. Esta respuesta puede aumentar el daño del tejido hepático y la fibrosis, lo que resulta en un aumento de la enfermedad hepática. A pesar de esto, es posible que el sistema CX3CL1/CX3CR1 pueda ser un blanco vulnerable para el bloqueo inflamatorio respuesta Th1. Fraticelli et al. Encontraron que el TNF-alfa y IFN gamma redujeron la expresión de CX3CL1 en las células endoteliales [17].
Además, la hepatitis crónica C (CHC) se caracteriza por una respuesta inmune ineficiente incapaz de eliminar por completo la infección por VHC en el hígado, permitiendo ciclos continuos de bajo nivel de destrucción de las células [16]. La inflamación intrahepática y lesión de las células del hígado son características de CHC, y son las principales causas de enfermedad hepática crónica que puede progresar a fibrosis avanzada y cirrosis [18]. Posiblemente, CX3CL1 está implicado en la fibrosis del hígado a través de los efectos pro-inflamatorios y pro-fibrogénesis [19]. Además, Wasmuth et al. Informarón que la expresión de CX3CR1 y su ligando, CX3CL1, está regulado en las enfermedades hepáticas crónicas como la CHC y que el sistema CX3CL1/CX3CR1 parece participar en la fibrosis hepática [2]: a) niveles de mRNA de CX3CR1 son altos en las biopsias hepáticas con fibrosis avanzada; b) CX3CR1 se expresa en las células Kupffer (macrófagos residentes) activadas y las células endoteliales sinusoidales, que promueven la infiltración de células inflamatorias; c) CX3CR1 se expresa en las HSCs activadas que son un tipo celular dominante productor de la proteína matriz extracelular durante la fibrosis del hígado; y d) el alelo 249I del gen de la CX3CR1 se asocia con altos niveles de mRNA de TIMP-1 y con la fibrosis hepática avanzada.
Dado que el eje CX3CL1/CX3CR1 juega un papel vital en la infección por VIH [20], nuestra cohorte de pacientes coinfectados por VIH/VHC podría ser inapropiados para analizar el efecto de los niveles CX3CL1 en la fibrosis hepática durante la infección por el VHC, debido a la variabilidad adicional y sin control de la infección por VIH. Sin embargo, no se encontró ninguna asociación entre los niveles plasmáticos de CX3CL1 con SIDA, CD4/microL, o la carga viral del VIH (datos no mostrados), tal vez porque nuestros pacientes en TARGA tenían una función inmune aceptable y una alta tasa de la carga viral indetectable. Por otra parte, de acuerdo con Wasmuth et al. [2], el receptor CX3CR1 de fractalquina se correlaciona con la fibrosis inducida por el VHC. Por lo tanto, es factible que la asociación observada en nuestro estudio pueda ser una característica de la infección por el VHC.
Además, no se encontró ninguna correlación entre la CC-quimiocinas (eotaxina, MCP-1, MIP-1-alfa, MIP-1-beta y RANTES) y el escore de fibrosis (datos no mostrados). Las CC-quimiocinas son secretados por el hígado durante la infección crónica por el VHC, y los altos niveles están fuertemente asociados con el reclutamiento de linfocitos, respuesta inmune, y la fibrogénesis [1]. Sin embargo, es posible que la infección por VIH interfiera con los niveles de producción y los valores plasmáticos de estas CC-quimiocinas, especialmente en pacientes con carga viral no controlada [21, 22]. Finalmente, no hemos encontrado asociación de CX3CL1 y los parámetros bioquímicos de función hepática, tal vez porque nuestros pacientes no tenían evidencia clínica de descompensación hepática.
Este estudio tiene varias limitaciones que deben tenerse en cuenta para una correcta interpretación de los datos:
a) Se trata de un estudio retrospectivo con un bajo número de pacientes y no hemos tenido suficiente pacientes con genotipos 2, 3, o 4 para la comparación con el genotipo 1 del VHC.
b) No se han podido conseguir pacientes monoinfectados por el VHC de genotipo 1 para evaluar si los resultados se repetirían en ausencia de infección VIH.
c) Se limita a pacientes con una función inmune bien preservada porque nuestro criterio de inclusión de la biopsia hepática fue que los pacientes tuvieran linfocitos CD4 + > 200 células/mm3. Es muy probable que los pacientes con un grado extremo de la inmunodeficiencia tuvieran mayores niveles plasmáticos de CX3CL1 porque el alto grado de activación inmune podría inducir CX3CL1 en las células endoteliales.
d) No podemos dar la información exacta con respecto a la longitud de la biopsia o espacios porta. Sin embargo, sólo hemos encontrado un 1,5% de las biopsias defectuosos para el diagnóstico patológico y estos casos fueron excluidos del estudio. En cualquier caso, el patólogo fue capaz de hacer el diagnóstico de la fibrosis en el 98,5% de las biopsias obtenidas.
e) Los niveles plasmáticos de CX3CL1 tuvieron bajo poder diagnóstico de la enfermedad hepática en nuestro estudio (datos no presentados), lo que limita su utilidad como escore clínico para el seguimiento de la fibrosis hepática en pacientes coinfectados por VIH-VHC.
En conclusión, los niveles plasmáticos de CX3CL1 se asocian con la enfermedad grave del hígado, lo que sugiere un papel de CX3CL1 en la patogénesis de la infección por VHC en pacientes coinfectados por VIH/VHC y con VHC de genotipo 1.
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