Publicado en: García-Álvarez M, Guzmán-Fulgencio M, Berenguer J; Micheloud D, Campos Y, López JC, Cosín J, Miralles P, Alvarez E, Resino S (*). European Mitochondrial DNA Haplogroups and Liver Fibrosis in Human Immunodeficiency Virus and Hepatitis C Virus Coinfected Patients. AIDS 2011; 25(13):1619-1926.
INTRODUCCIÓN
Las mutaciones en el ADN mitocondrial (ADNmt) adquiridas a lo largo de la historia han subdividido la población humana en un número discreto de clados o haplogrupos mitocondriales, que se definen en función de los polimorfismos de un solo nucleótido específicos mitocondriales (mtSNPs) dispersos por todo el genoma mitocondrial [1, 2]. En los caucásicos europeos, 4 clúster de ADNmt o macro-haplogrupos (HV, U; JT y IWX) y varios haplogrupos principales han sido identificados (H, V, J, T, Uk, W, X, I, etc) [3].
Las mitocondrias son fundamentales para la producción de energía y están involucradas de forma natural en varias rutas metabólicas relacionadas con trastornos metabólicos [4]. Además, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) como un subproducto tóxico durante la disfunción mitocondrial puede jugar un papel central en una amplia gama de trastornos tales como el cáncer, el SIDA, la sepsis, la diabetes, y enfermedades degenerativas, que están asociados al haplogrupo de ADNmt [5]. Por lo tanto, se ha sugerido que algunos de estos polimorfismos asociados a haplogrupo podrían actuar como factores de riesgo o factores de protección para estos trastornos y la progresión de estas enfermedades [5-8].
La coinfección con el virus de la hepatitis C (VHC) es común entre los pacientes infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) porque ambos virus comparten las mismas vías de transmisión. La hepatitis C crónica en pacientes infectados por el VIH se caracteriza por una mayor tasa de progresión de la fibrosis, cirrosis y enfermedad hepática en fase terminal en comparación con los pacientes VHC mono-infectados [9, 10]. La infección por el VHC puede conducir a la disfunción mitocondrial debido al aumento de la lipoperoxidación, que a su vez puede conducir al agotamiento del ADN mitocondrial (ADNmt), dando lugar a un aumento de la producción de ROS que posiblemente contribuye a un aumento del daño hepático por el VHC [11]. Hay evidencia de daño mitocondrial producido por el VIH mismo y después de la terapia con inhibidores análogos de nucleósidos de la transcriptasa reversa (INRT). Factores de virulencia del VIH han demostrado que pueden causar daño mitocondrial in vitro y pueden inducir la apoptosis celular a través de la vía mitocondrial [12]. Por otra parte, los fármacos antirretrovirales también pueden causar disfunción mitocondrial en el hígado (actividad disminuida del complejo respiratorio I, pero aumento de la actividad del complejo respiratorio IV) y el agotamiento de ADNmt en pacientes con VIH, añadido a cualquier daño mitocondrial causado por la infección de la hepatitis C crónica [13]. Además, ciertos fármacos tales como los análogos de timidina son potentes inhibidores de la ADN polimerasa gamma mitocondrial [14], y por lo tanto con más probabilidad de infligir daño al hígado que otros fármacos [15].
Nuestra hipótesis fue que la infección por VIH, la enfermedad hepática por VHC y los polimorfismos del ADN mitocondrial son tres factores interrelacionados que podrían estar asociados con la progresión de la enfermedad hepática. En consecuencia, se realizó el presente estudio con el fin de explorar si los haplogrupos de ADN mitocondrial tuvieron alguna influencia sobre la progresión de la fibrosis hepática en pacientes coinfectados por VIH/VHC.
PACIENTES Y MÉTODOS
Pacientes
Se realizó un estudio transversal en pacientes coinfectados VIH/VHC que se sometieron a una biopsia de hígado en el Hospital Gregorio Marañón (Madrid, España) entre septiembre de 2000 y noviembre de 2008, y que tenían una muestra de ADN recogida y congelada en el mismo día de la biopsia de hígado. Las biopsias de hígado se realizaron en pacientes que eran candidatos potenciales para recibir la terapia anti-VHC. Los criterios de elegibilidad para la terapia anti-VHC incluyeron ausencia de descompensación hepática previa, recuento de células CD4+>200 células/µl, terapia antirretroviral estable o sin necesidad de terapia antirretroviral, la ausencia de infecciones oportunistas activas, sin drogadicción activa, y ausencia de otras enfermedades concomitantes o condiciones que contraindiquen la terapia de interferón más ribavirina. De nuestra cohorte de 361 pacientes coinfectados VIH/VHC con datos de la biopsia de hígado, 243 pacientes tenían una muestra de ADN recogido y congelado y 231 de estos 243 pacientes tenían un macro-haplogrupo mitocondrial europeo »N» que es ancestral a casi todos los países europeos y muchos haplogrupos euroasiáticos [3].
Además, los 126 donantes de sangre sanos (sujetos VIH y VHC negativos) del Centro de Transfusión de la Comunidad de Madrid participaron como grupo de control. El estudio se realizó de conformidad con la Declaración de Helsinki. Todos los pacientes dieron su consentimiento por escrito para la biopsia hepática y el Comité Institucional de Ética aprobó el estudio.
Datos clínicos y de laboratorio
En el día de la biopsia hepática, se obtuvo la siguiente información de las historias clínicas: edad, género, categoría de riesgo, peso, talla, categoría clínica del CDC, recuento de células T CD4 nadir, la terapia antirretroviral previa, el tratamiento antirretroviral en el momento de la biopsia hepática, y el tiempo total de la terapia antirretroviral de gran actividad (TARGA). Los pacientes fueron interrogados en relación con el consumo de alcohol. Se consideró el consumo de más de 50 gramos de alcohol por día para ? 12 meses, como un alto consumo. La altura y el peso se determinaron al inicio del estudio, y el índice de masa corporal (IMC) se calculó como el peso en kilogramos dividido por el cuadrado de la altura en metros. El grado de resistencia a la insulina (IR) se calculó para cada paciente usando el modelo de evaluación homeostático (HOMA): glucosa en plasma en ayunas (mmol/L) por la insulina sérica en ayunas (mU/L) dividido por 22,5 [16]. Al igual que en otros estudios, la IR se consideró alterado cuando la puntuación HOMA fue de 3,8 o superior [17].
Virología
La infección por el VIH fue documentada en todos los pacientes por ensayo inmunoenzimático y ensayo de Western blot. Todos los pacientes dieron positivo para anticuerpos de VHC específicos y el ARN del VHC era detectable de en suero como se evaluó por PCR. La carga viral de VHC se midió mediante PCR (Cobas Amplicor HCV Monitor Test, Branchburg, New Jersey, United States) y los resultados se informaron en UI/ml. El genotipo del VHC se determinó mediante la hibridación de productos de PCR marcados con biotina con sondas de oligonucleótidos unidos a tiras de membrana de nitrocelulosa (INNO-LiPA HCV II, Innogenetics, Gante, Bélgica).
Biopsia hepática y fibrosis
Las biopsias de hígado se realizaron de forma ambulatoria siguiendo las recomendaciones de la Comisión de Atención al Paciente de la Asociación Gastroenterológica Americana [18]. Todas las biopsias de hígado fueron realizadas por los mismos médicos (JB y PM) con una aguja de aspiración (HISTO -CUT 16G, Sterylab Srl. Milano, Italia). El ultrasonido se utilizó de manera rutinaria para determinar el lugar de la biopsia percutánea. Las secciones de tejido hepático fueron fijadas en formol, embebidos en parafina y teñidas con hematoxilina -eosina, tricrómico de Mason, y el hierro de Perls. Las muestras fueron evaluadas por un patólogo (EA) que desconocía los datos clínicos o de laboratorio
de los pacientes.
La fibrosis hepática se estimó siguiendo los criterios establecidos por el Grupo de Estudio Cooperativo METAVIR [19]. La fibrosis se puntuó de la siguiente manera: F0, sin fibrosis, F1, fibrosis portal, F2, fibrosis periportal o escasos septos portal-portal, F3, septos fibrosos con distorsión de la arquitectura, sin cirrosis obvia (fibrosis en puente) y F4, cirrosis definida.
En cada paciente, se calculó la tasa de progresión de la fibrosis (FPR) dividiendo el estadio de la fibrosis (0 a 4) por la duración estimada de la infección por VHC en años. Por ejemplo, para un paciente con fibrosis estadio 2 (F2) y una duración de 10 años de la infección por VHC, el FPR es 0,2. Seleccionamos un punto de corte de 0,1 (cerca del percentil 75) para clasificar a los pacientes, como previamente se había realizado en otro artículo [20]. La duración de la infección por el VHC se calculó asumiendo que la infección por el VHC se adquirió el primer año que se compartieron agujas.
Genotipado de ADNmt
Se extrajo ADN genómico a partir de sangre periférica usando columnas Qiagen (QIAamp DNA Blood Midi/Max; Qiagen, Hilden, Alemania). El ADN recuperado se cuantificó por espectrofotometría (Tecan Infinite® 200 PRO Microplate Reader, Tecan Group Ltd., Männedorf, Suiza), diluido a una concentración madre de 50 ng/l, y se almacenó a -70 ºC. Una alícuota del ADN de cada paciente se amplificó (GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)) y se envió a genotipar el ADNmt en el Centro Nacional de Genotipado Español (CeGen; http://www.cegen.org/) con plataforma MassARRAY de Sequenom (San Diego, CA, USA), utilizando el diseño de sistema de ensayo iPLEX® Gold assay.
Nuestro estudio incluyó españoles dentro del macro-haplogrupo N que es ancestral a casi todos los haplogrupos europeos y muchos euroasiáticos [3]. Los haplogrupos dentro del subconjunto de Europa Occidental (N) fueron analizados mediante los SNPs en el Haplogrouping mitocondrial por el enfoque funcional de variantes candidatas (MHCFV) descrito por Hendrickson et al [7]. Las personas que no se encontraban dentro del macro-haplogrupo N (que se encuentra en África y Asia oriental) fueron excluidas del estudio.
Análisis estadístico
Se utilizó la prueba ANOVA para comparar las medias entre los grupos. Los datos categóricos y las proporciones se analizaron mediante el test de chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher cuando fue necesario. Todas las pruebas fueron de dos colas con valores de p<0,05 que se consideraron significativos. El análisis estadístico se realizó mediante el programa SPSS 15.0 (SPSS Inc., Chicago,
IL, EE.UU.).
El análisis de regresión logística se realizó para analizar el posible efecto de los haplogrupos de ADN mitocondrial en el desarrollo de la fibrosis hepática (fibrosis avanzada (F ? 3) y cirrosis (F4)) y la tasa de progresión de la fibrosis (FPR). Cuando se calcularon los odds ratios las categorías de referencia eran todos los demás haplogrupos. Las variables utilizadas en el modelo ajustado fueron el sexo, la edad, el IMC, el recuento de células T CD4 nadir, ARN del VIH indetectable, el tiempo en TARGA, TARGA actual con análogos de timidina (AZT, ddI, d4T), ARN del VHC ? 850.000 UI/mL, VHC genotipo 1, la resistencia a la insulina (HOMA ? 3,8), y el alto consumo de alcohol.
RESULTADOS
Características de los pacientes
La Tabla 1 muestra las características clínicas y epidemiológicas de los 231 pacientes coinfectados por VIH/VHC que se autoidentificaron como »blancos» y tenían un macro-haplogrupo mitocondrial »N» o europeo occidental.
Tabla 1. Características de los 231 pacientes coinfectados VIH/VHC que poseen el macro-haplogrupo mitocondrial N.
*Valor absoluto (porcentage). #Mediana (percentil 25; percentil 75). (†) El consumo de alcohol superior a 50 gramos/día durante ?12 meses se consideró un alto consumo. Abreviaturas: ALP: Fosfatasa alcalina. ALT: alanina aminotransferasa. AST: aspartato aminotransferasa. GGT: gamma glutamil transpeptidasa. HOMA: modelo homeostático. IMC: índice de masa corporal. Prior ADCs: antecedentes de condiciones definitorias de SIDA. TARGA: tratamiento antirretroviral de gran actividad. UDVP: usuario de drogas por vía parenteral. VHC: Virus de la hepatitis C. VHC-ARN: carga viral plasmática de VHC. VIH-1: Virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1. VIH-ARN: carga viral plasmática de VIH.
No encontramos diferencias significativas en las frecuencias de haplogrupos de ADN mitocondrial entre los pacientes coinfectados por VIH/VHC y el grupo control sano, a excepción de los haplogrupos Uk y X, que fueron menos frecuentes en los pacientes coinfectados por VIH/VHC (Tabla 2). Se realizaron pruebas de asociación genética en los macro-haplogrupos HV, U, JT y IXW y sobre los haplogrupos H, V, Uk, J, T, I, X y W. Sin embargo, los haplogrupos Pre-V, Uk, I, X y W tenían frecuencias absolutas de menos de 10 y por lo tanto se incluyeron en haplogrupos más amplios para minimizar errores de tipo I.
Tabla 2. Frecuencias de distribución de los haplogrupos de ANDmt en 213 pacientes coinfectados VIH/VHC y en 126 controles sanos.
| Haplogrupos ADNmt | Controles sanos | Pacientes VIH/VHC | Valor-p |
| HV | 70 (55.6) | 120 (51.9) | 0.579 |
| H | 59 (46.8) | 100 (43.3) | 0.578 |
| V | 5 (4) | 15 (6.5) | 0.471 |
| Pre-V* | 6 (4.8) | 5 (2.2) | 0.206 |
| U | 25 (19.8) | 58 (25.1) | 0.295 |
| Uk | 7 (5.6) | 4 (1.7) | 0.057 |
| JT | 22 (17.5) | 43 (18.6) | 0.886 |
| J | 13 (10.3) | 19 (8.2) | 0.562 |
| T | 9 (7.1) | 24 (10.4) | 0.346 |
| IWX | 9 (7.1) | 10 (4.3) | 0.324 |
| I | 2 (1.6) | 6 (2.6) | 0.718 |
| X | 6 (4.8) | 3 (1.3) | 0.072 |
| W | 1 (0.8) | 1 (0.4) | 1.00 |
* Pre-V: macro-haplogrupo HV pero no H ó V [33]. Valor absoluto (porcentage). Abreviaturas: VHC, Virus hepatitis C; VIH-1, Virus de la inmunodeficiencia humana tipo-1.
Influencia del haplogrupo de ADNmt en la fibrosis hepática
La frecuencia de pacientes coinfectados por VIH/VHC con F3 o F4 tenía una tendencia lineal a la baja con significación estadística en el macro-haplogrupo HV y el haplogrupo H (Figura 1). El haplogrupo U tuvo una alta frecuencia de pacientes con cirrosis, pero el valor de p no fue significativo.
Figura 1. Frecuencia de los pacientes coinfectados por VIH/VHC separadas por el estadio de fibrosis hepática dentro de cada haplogrupo ADNmt. Los estadios de fibrosis se ordenan en una escala creciente de grises desde el blanco (F0) a negro (F4). Los valores de p se obtuvieron con la asociación lineal por lineal de la prueba chi-cuadrado.
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La Tabla 3 muestra las asociaciones significativas que existen para los haplogrupos mitocondriales HV, H y U con el estadio de fibrosis hepática y FPR de acuerdo al análisis de regresión logística univariante. En concreto, el macro-haplogrupo HV se asoció significativamente con la reducción de las probabilidades de fibrosis avanzada (F?3), cirrosis (F4), y tasa de progresión de la fibrosis alta (FPR? 0,1). Dentro del macro-haplogrupo HV, el haplogrupo H también tenía menos probabilidad de fibrosis avanzada, cirrosis o alta FPR. También se encontró una asociación significativa con el aumento de las probabilidades de la cirrosis (F4) en el macro-haplogrupo estrechamente relacionado U (Tabla 3).
Tabla 3. Resumen del análisis de regresión logística simple para evaluar la asociación de los haplogrupos de ADN mitocondrial significativos con la progresión de la fibrosis hepática en 231 pacientes coinfectados VIH/VHC.
Abreviaturas: VHC, Virus hepatitis C; VIH-1, Virus inmunodeficiencia humana tipo-1; OR, odds ratio; IC95%, intervalo de confianza de 95%.
La Figura 2 muestra la asociación entre los haplogrupos mitocondriales y la fibrosis hepática ajustada por las características epidemiológicas, clínicas y virológicas. Tomando F0-F1-F2 como categoría de referencia, se encontró que la probabilidad ajustada (OR) de tener F3-F4 disminuía significativamente en los haplogrupos HV y H. Este efecto no se encontró en el haplogrupo U (Figura 2A). Cuando F<4 se tomó como la categoría de referencia, se encontró que la OR ajustada de tener F4 también se reducía significativamente en los haplogrupos HV y H, y aumentaba en el haplogrupo U (Figura 2B). Por último, cuando FPR? 0,1 se tomó como la categoría de referencia, encontramos que la OR ajustada de tener un FPR> 0,1 se redujo significativamente en los haplogrupos HV y H. Este efecto no se encontró en el haplogrupo U (Figura 2C).
Figura 2. Asociación de haplogrupos de ADN mitocondrial y la progresión de la fibrosis hepática en 231 pacientes coinfectados VIH/VHC. Todos los análisis se ajustaron por edad, sexo, alto consumo de alcohol, el nadir del recuento de células CD4 +, carga viral indetectable del VIH, el VHC-ARN ? 850000, VHC genotipo 1, el tiempo en TARGA, TARGA actual con análogos de timidina (AZT, ddI, d4T), índice de masa corporal, y resistencia a la insulina (HOMA ? 3,8).
En este estudio, hemos examinado la asociación genética entre los principales haplogrupos europeos de ADN mitocondrial y la fibrosis hepática en 231 pacientes coinfectados VIH/VHC. Se encontró que el macro-haplogrupo mitocondrial HV y el haplogrupo H estaban fuertemente asociados con probabilidades reducidas de fibrosis avanzada, cirrosis, y progresión de la fibrosis, mientras que el macro-haplogrupo U estaba fuertemente asociado con un aumento de las probabilidades de cirrosis. Hasta donde conocemos, este es el primer estudio para identificar una asociación entre haplogrupos de ADN mitocondrial y la fibrosis hepática en pacientes con hepatitis C crónica, y también los primeros en caracterizar haplogrupos mitocondriales entre los pacientes coinfectados por VIH/VHC.
Los haplogrupos de ADN mitocondrial se han utilizado más ampliamente para entender las migraciones prehistóricas y la evolución humana [2]. Un estudio reciente en la población europea ha demostrado que, en general, los más frecuentes fueron los haplogrupos H (41%) y U (21%). Haplogrupos menos frecuentes fueron J y T, cada uno con una frecuencia del 8%. Las frecuencias de los otros haplogrupos (V, Pre-V, Uk, W, X, y I) no superan el 5% [21]. Nuestros resultados mostraron que la distribución de haplogrupos de ADN mitocondrial en nuestros pacientes coinfectados por VIH/VHC se correspondía con la encontrada por otros autores en toda la población europea [21] y la población de raza blanca con infección por el VIH [7, 22]. Sin embargo, se encontró una baja frecuencia de haplogrupos Uk y X entre los pacientes coinfectadosl VIH/VHC con respecto a nuestros controles sanos de edad y sexo similar. Sin embargo, creemos que estas diferencias podrían deberse al azar, debido a que las frecuencias absolutas de estos haplogrupos fueron muy bajas en nuestros pacientes coinfectados por VIH/VHC y los controles sanos.
Sólo recientemente se ha considerado la importancia potencial del haplogrupo mitocondrial para la salud humana y la enfermedad. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a las diferencias funcionales entre los haplogrupos son aún desconocidas [5, 23]. En los pacientes VIH negativos, la asociación de los haplogrupos de ADN mitocondrial europeos con la evolución de las enfermedades infecciosas es contradictoria [6, 24, 25]. El haplogrupo H se ha asociado con un aumento de las tasas de supervivencia en individuos con sepsis [6], pero otros estudios no mostraron una asociación del haplogrupo con riesgo de infección o de supervivencia [24, 25]. Los haplogrupos de ADN mitocondrial se han estudiado previamente en pacientes infectados por el VIH [7, 8, 22, 26, 27] mostrando una asociación del haplogrupo ADNmt con la progresión de la enfermedad del VIH y algunos efectos secundarios de la terapia antirretroviral como la lipodistrofia, la neuropatía periférica y el trastorno neurorretiniano. Cabe destacar que en uno de estos estudios encontraron una asociación de los haplogrupos J y U5a con una mayor progresión del SIDA, mientras que el haplogrupo H3 se asoció con una disminución de la progresión del SIDA y la muerte en los pacientes infectados por el VIH no tratados previamente [7].
Hasta donde conocemos, los estudios de haplogrupos de ADN mitocondrial no se han llevado a cabo en pacientes con hepatitis C crónica, ya sea en VHC monoinfectados o en coinfectados VIH/VHC. En nuestro estudio, después de ajustar por las características epidemiológicas, clínicas y virológicas relacionadas con la coinfección por VIH/VHC, el haplogrupo desacoplado U (menor producción de ATP y de ROS) se asoció con la cirrosis. Pertenecer al haplogrupo U podría acelerar la fibrosis hepática mejorando así los efectos del agotamiento de ADNmt, la alteración de los complejos de la fosforilación oxidativa, la deficiencia de la enzima antioxidante, y la apoptosis [7]. Por el contrario, los haplogrupos más estrechamente acoplados HV y H (mayor producción de ATP y ROS) se asociaron con la reducción de las probabilidades de fibrosis hepática avanzada o cirrosis en nuestros pacientes. Los haplogrupos HV y H podrían presentar un aumento de la producción de ATP y ROS, mejorando la inmunidad innata y la contribución a la progresión lenta de la enfermedad [7]. En este punto, nos enfrentamos a una contradicción en nuestros datos, ya que a pesar de que el haplogrupo H puede producir más ROS y aumentar el daño oxidativo en el hígado, en nuestros pacientes de los haplogrupos HV y H presentaron menos probabilidades de fibrosis. Sin embargo, sólo un aumento de la generación de ROS, junto con la disminución de las defensas antioxidantes promueve el desarrollo y la progresión de las complicaciones hepáticas durante la infección por el VHC [28]. También es posible que mayores tasas de producción de ROS puedan conducir a : a) una sobre-regulación de las defensas antioxidantes [32], hasta tal punto que ROS no cause daño grave al hígado, y b) una buena función inmune retrasando el proceso de fibrosis en pacientes coinfectados por VIH/VHC [29], y la garantía de un buen control del VIH y la replicación del VHC, que a su vez puede disminuir la producción de ROS y apoptosis [30, 31]. Además, es posible que el grado de eficiencia energética tenga un impacto más grande que la generación de ROS en la fisiopatología de la hepatitis C crónica, lo que permite que los pacientes con haplogrupos HV y H tengan una progresión más lenta que los pacientes con el haplogrupo U.
Este estudio tiene varias limitaciones que deben ser tenidas en cuenta para la correcta interpretación de los datos: a) el diseño del estudio es transversal, b) el número de pacientes es bajo para un estudio de epidemiología genética, c) no incluimos pacientes monoinfectados por VHC, y d) el estudio fue realizado con haplogrupos europeos, y el SIDA y las epidemias de hepatitis C crónica tienen cada vez más personas afectadas de ascendencia no europea. Es fundamental definir las relaciones entre los haplogrupos mitocondriales y la alteración metabólica en estas otras poblaciones.
En conclusión, los haplogrupos de ADN mitocondrial HV y H se asociaron con una progresión más lenta de la fibrosis y el haplogrupo U se asoció con una progresión de la fibrosis más rápida en los pacientes coinfectados por VIH/VHC, lo que sugiere que el haplogrupo de ADNmt puede jugar un papel significativo en la fibrogénesis hepática en pacientes con hepatitis C crónica.
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