Reacciones inmunoenzimáticas II

4. REACCIONES INMUNOENZIMÁTICAS II.

4.1. RADIOINMUNOENSAYO (RIA).

4.1.1. RIA EN FASE LÍQUIDA.

4.1.2. RIA EN FASE SÓLIDA.

4.2. DETECCIÓN DE PROTEÍNAS SOBRE SOPORTES.

4.2.1. DOT-ELISA.

4.2.2. WESTERN BLOT (WB).

4.2.3. ELISPOT.

4. REACCIONES INMUNOENZIMÁTICAS II.

4.1. RADIOINMUNOENSAYO (RIA).

El principio general del RIA es la INHIBICIÓN COMPETITIVA de la unión de un Ag radioactivo, conocido como trazador, a sus Ac específicos por parte del Ag no marcado:

Ac + Ag* <—————> Ac-Ag*

Ac + Ag <—————> Ac-Ag

Cuanto mayor sea la cantidad de Ag no marcado presente, menor será la cantidad de trazador que se une al Ac. La cantidad de trazador libre se determina mediante recuento en un contador de centelleo líquido o en un contador gamma, que mide el tipo y la cantidad de radiación emitida. clip_image002

Se puede determinar la concentración de un Ag en el suero con suficiente especificidad y sensibilidad, si el marcador es lo suficientemente radiactivo, y se puede colocar en concentraciones infinitesimales, y si el Ac es altamente específico. Se usa para determinar hormonas, Ac anti DNA, etc.

4.1.1. RIA EN FASE LÍQUIDA.

Hay que hacer dos ensayos fundamentales:

Titulación del antisuero: incubar diferentes concentraciones de Ac con el Ag* marcado y valorado (trazador) para seleccionar la concentración de Ac óptima (mediante la elaboración de una curva patrón) para el desarrollo posterior de la prueba.

Ensayo de desplazamiento: incubación conjunta del Ag* marcado y valorado, el antisuero previamente titulado (Ac valorado) y la muestra problema que contiene el Ag a determinar. El Ag compite con el Ag* en su unión al Ac titulado.

A mayor concentración de Ag en el suero problema, mayor concentración de Ag* libre. Para medir el Ag* libre, se elimina el Ag* unido mediante precipitación de los IC.

4.1.2. RIA EN FASE SÓLIDA.

Se han desarrollado para facilitar la separación entre los Ag* libres y los Ag* unidos a los IC. Los pasos son los siguientes:

– Fijación del Ag sobre un soporte (tubo o placa de plástico). Lavar para eliminar el exceso el exceso de Ag.

– Bloqueo o postapizado de la placa con ovoalbúmina, que tapa las zonas libres de la placa para que no fijen Ac o Ag (esta técnica también se usa en el ELISA).

– Adición de la muestra problema donde se quieren determinar los Ac. Lavar para eliminar los Ac no unidos.

– Adición de anti-Ac radiomarcados (conjugado) y lavar para eliminar el exceso.

– Medir la radiactividad de la placa en un contador.

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4.2. DETECCIÓN DE PROTEÍNAS SOBRE SOPORTES.

El método se basa en detectar proteínas (Ag en solución) tras su fijación sobre membranas de nitrocelulosa (NC), y posterior revelado mediante la adición de Ac mercados con enzimas.

4.2.1. DOT-ELISA.

La fijación de las proteínas a la membrana se lleva a cabo a cabo a partir de soluciones proteicas complejas: método de manchas o DOT-ELISA.

Permite la fijación de gran cantidad de proteínas y, por tanto, la detección de componentes que se encuentran en pequeña cantidad en una mezcla compleja.

Procedimiento:

– Depositar sobre la lamina de NC una pequeña gota de Ag y dejar secar bajo una lámpara.

– Bloquear la lamina de NC con un posttapizado.

– Sumergir las muestras problemas en las soluciones de Ac, y lavar tras incubación.

– Incubar en la solución de Ac marcado con enzima, y lavar tras incubación.

– Incubar con el sustrato adecuado. En la zona de sembrado del Ag se deposita el precipitado coloreado.

4.2.2. WESTERN BLOT (WB)

Se basa en la separación de los antígenos virales mediante una electroforesis en gel de SDS-PAGE (lo cual proporciona una carga negativa a la proteínas).

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– Las proteínas son sometidas a una electroforesis en un gel de poliacrilamida. Como las proteínas están cargadas negativamente se separan con base en su peso molecular (las más grandes permanecen en la parte superior del gel y las menores migran hacia la base). clip_image008

– Las proteínas se transfieren a un soporte sólido (papel de nitrocelulosa, nylon), lo cual da una copia exacta del patrón del gel en la matriz.

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– La identificación de las proteínas a estudiar se realiza usando un ELISA indirecto (INMUNOBLOTTING). Las reacciones se leen como positivas cuando una línea de precipitación o color se forma en el peso molecular correcto para una proteína particular.

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El marcaje puede ser por:

A) Tinción no específica de proteínas totales:

– GEL: Azul de Comassie.

– MEMBRANA: Rojo Ponceau, Tinta china, Negro Amido.

B) Tinción específica de proteínas (membrana): uso de Ab.

– Ab unidos a enzimas: la enzima cataliza una reacción dando lugar a un precipitado coloreado o que emite luz.

  • – Enzimas: HRP (peroxidasa de rábano) / Fostatasa alcalina.
  • – Sustratos: Quimioluminiscentes: Luminol
  • – Colorimétricos: DAB, TMB, CNF.

– Ab que emiten radiaciones ionizantes.

– Ab unidos a prot. A o G asociada a oro coloidal.

Tipos de marcaje.

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4.2.3. ELISPOT

· La técnica de ELISPOT es un ensayo que se utiliza en inmunología para detectar las células que secretan un anticuerpo, una granzima o una citocina específico.

· ELISPOT es una herramienta muy potente para el análisis de funciones inmunológicas de células linfoides de sangre periférica. Este técnica permite la detección, enumeración y caracterización de células secretoras de Anticuerpos y citocinas a nivel individual

· ELISPOT fue derivada del sandwich enzyme-linked immunosorbent assay ELISA, e incorpora el ensayo inmunoenzimático en fase sólida ELISA

· Esta técnica fue desarrollada por la BD Biosciences utiliza Anticuerpos purificados NA/LE (en sodium azide/low endotoxin) adsorbidos en placas com pozos cubiertos por una membrana de Polyvinylidene difluoride (PVDF)

· – Prueba diseñada originalmente para la detección de células B secretoras de anticuerpos antígeno específicos. Ahora, se ha adaptado para la detección de células secretoras de citocinas específicas u otros antígenos.

· Es un método sensible y selectivo para el estudio de citocinas, no requiere estimulación previa para reflejar la situación in vivo. Para células T, por ejemplo, el IFN-? secretado por las células en cultivo, es capturado en las inmediaciones de la células por un anticuerpo específico anti- IFN-? adsorbido en el fondo del pozo.

· Las células se retiran mediante lavados sucesivos y se adiciona un segundo anticuerpo específico anti-IFN-?, marcado con una enzima, el cual va a adherirse al interferón inmovilizado por el primer anticuerpo; al adicionar el sustrato de la enzima, se forma un producto colorido insoluble que permite ver el sitio en donde se encontraba la célula secretora de IFN-? como una mancha de color.

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