El virus gripal pandémico H1N1

1. Clasificación, morfología y características

Los virus de la gripe pertenecen a la familia Orthomyxoviridae, virus de tamaño mediano, ARN monocatenario y simetría helicoidal. Están provistos de una membrana de envoltura de origen lipídico ¹. El nombre Orthomyxoviridae hace referencia a la afinidad que presentan por la mucina, mucoproteína presente en el moco de diversas secreciones y en algunos receptores epiteliales, en la membrana de los hematíes y en el suero (de ahí su capacidad hemaglutinante) ², ³.

Esta familia incluye cinco géneros, en base a sus diferencias genómicas y estructurales (Tabla 1). El virus pandémico del 2009 se incluye en el género Influenzavirus A de esta familia.

Tabla 1: Clasificación de los vírus Orthomyxoviridae

Desde el punto de vista morfológico, los viriones tienen un diámetro de 80 a 120 nm, son pleomórficos pero tienden a adquirir una forma esférica o filamentosa en función de la cepa y el tipo de célula hospedadora ⁴, ⁵. Su envoltura lipídica deriva de la membrana plasmática de la célula infectada (Figura 1).

Figura 1: Morfología y componentes principales del virus de la gripe A. Modificado de R. Ortiz de Lejarazu.

En la superficie interna de la envuelta se encuentra el armazón proteico del virus, compuesto principalmente por la proteína M1, a la que se asocia la proteína NEP (Nuclear Export Protein), implicada en la exportación de las ribonucleoproteínas (RNPs) al citoplasma ^6-35. Atravesando la membrana lipídica encontramos la proteína M2, que forma un canal iónico de gran importancia para la correcta infectividad de las partículas virales ⁷.

Más internamente en la estructura y atravesando también la envoltura, a modo de proyecciones, se disponen dos glicoproteínas, la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA). La glicoproteína NA forma un homotetrámero ⁸, ⁹ y presenta forma de bastón, mientras que la HA forma un homotrímero ¹⁰ y su estructura termina en una forma globular (Figura 2).

Figura 2: Distribución de las hemaglutininas y neuraminidasas en la superficie del virus Influenza, según su disposición espacial. Fuente: Harris A. et al. PNAS 2006, 13: 19123-7. ¹¹

La HA es el componente glicoproteíco mas importante y constituye el 25 % de las proteínas víricas. Es la responsable tanto de la fijación del virus a los receptores mucoproteícos de las células del epitelio respiratorio como de la fusión entre la envoltura vírica y la membrana celular. Es uno de los principales antígenos del virus siendo el desencadenante fundamental de la producción de anticuerpos neutralizantes ¹².

La NA es una N-acetilneuraminilhidrolasa, enzima que cataliza la liberación del ácido N-acetilneuramínico, constituyente de todas las mucinas. Su función principal es la liberación de las partículas virales de las mucosas permitiendo el ingreso del virus en la célula así como la liberación y difusión de nuevos viriones y apoptosis celular. Al igual que la HA, contiene determinantes antigénicos específicos de cada cepa ¹².

En la parte más interna se localiza la nucleocápside, que contiene ocho fragmentos de ARN monocatenario de polaridad negativa superenrollado ¹³ asociado a la nucleoproteína (NP) ¹⁴ y las polimerasas (PB1, PB2 y PA), que constituyen el complejo enzimático viral encargado de la síntesis del ARN.

Las ocho ribonucloproteínas (RNPs) contienen aproximadamente 13.500 nucleótidos y codifican las once proteínas mediante mecanismos de procesamiento alternativo (splicing) y la utilización de una fase de lectura abierta (ORF) alternativa del ARNm ¹⁵ (Tabla 2).

Tabla 2: Segmentos genómicos de los virus gripales A. Polipéptidos y sus funciones.

Modificado de R. Ortiz de Lejarazu.

Se han descrito dos proteínas no estructurales del virus (NS1 y PB1-F2) que se encuentran en las células infectadas pero no están presentes en la partícula viral. Estas proteínas se han descubierto recientemente y su función exacta todavía se desconoce. NS1 ejerce un gran número de funciones en distintas etapas de la infección, sobre todo relacionadas con la evasión de la respuesta inmune celular y con la regulación de procesos que llevan a optimizar la expresión de las proteínas virales. Se localiza preferentemente en las mitocondrias de la célula infectada y se la ha relacionado con procesos de apoptosis durante la infección ¹⁶, ¹⁷.

2. Variaciones antigénicas

Los virus gripales poseen dos clases de antígenos: los antígenos internos específicos de tipo, NP y M1 y los antígenos superficiales específicos de subtipo, HA y NA ¹⁸, ¹⁹. Hasta la fecha se conocen 16 HA y 9 NA distintas, todas ellas descritas en aves, aunque entre las gripes de origen aviar las más comunes y patogénicas son los virus H5 y H7 ²⁰ (Tabla 3).

Tabla 3: Hospedadores naturales de los virus de la gripe A.

Hospedadores naturales de los virus de la gripe A
Hemaglutinina		Neuraminidasa
Subtipo	Hospedadores predominantes	Subtipo	Hospedadores predominantes
H1	Humanos, cerdos, aves	N1	Humanos, cerdos, aves
H2	Humanos, cerdos, aves	N2	Humanos, cerdos, aves
H3	Aves, humanos, cerdos, caballos	N3	Aves
H4	Aves	N4	Aves
H5	Aves, (humanos)	N5	Aves
H6	Aves	N6	Aves
H7	Aves, caballos (humanos)	N7	Caballos, aves
H8	Aves	N8	Caballos, aves
H9	Aves, (humanos)	N9	Aves
H10	Aves
H11
H12
H13
H14
H15
H16

Modificado de Nicholson KG et al. Influenza. Lancet 2003; 362

Esta variabilidad antigénica es característica de los virus influenza A y se debe a que estos virus ARN tienen mecanismos de mutación y recombinación que les permite cambiar y adquirir una mayor o menor virulencia y patogenicidad e incluso la capacidad de atravesar las barreras de susceptibilidad inter-especies ²¹, ²².

Se trata de un proceso de evolución continua mediado por mutaciones que les permite adaptarse al hospedador y a las condiciones del ambiente. Es una evolución obligada conocida como presión selectiva ²³. Los cambios son sustituciones de nucleótidos, delecciones e inserciones de tripletes causados principalmente por los errores de la polimerasa de ARN durante la transcripción. Estas mutaciones se van acumulando en cada ciclo de transcripción y generan variantes de función o estructura de las proteínas ²⁴.

La frecuencia de mutación de los virus de la gripe es de 1:100.000 de nucleótidos. Estas nuevas variantes obtienen una ventaja evolutiva ya que los anticuerpos existentes no podrían neutralizar al virus.

Existen dos tipos de cambios principalmente:

– Variaciones menores o deriva antigénica (antigenic drift): Afectan principalmente a la HA y la NA y suponen la aparición de una cepa frente a la cual, la población presenta una inmunidad parcial por exposiciones previas a las cepas originales. Se produce por tanto una selección inmunológica de mutantes de escape inmune. Las epidemias anuales de gripe se producen como consecuencia de estas variaciones menores ²⁵.

– Variaciones mayores o reemplazo antigénico (antigenic shift): Implican la aparición de una cepa antigénicamente nueva. Si estos cambios se dan en genes que codifican para la HA o la NA la cepa resultante podría extenderse rápidamente y provocar una gran morbilidad y mortalidad en toda la población, incluyendo gente joven y sana, ya que la inmunidad previa existente no sería capaz de frenar el desarrollo de la infección. Estos cambios antigénicos son responsables del origen de la grandes pandemias de gripe de la historia ²¹, ²² y por lo tanto del origen del virus pandémico H1N1 del 2009.

Existen dos hipótesis que explican el origen de las variaciones mayores:

– Reordenamiento genético: Este proceso consiste en un intercambio de genes de virus procedentes de diferentes especies que co-infectan al mismo huésped ²⁵. Para que el reordenamiento pueda llevarse a cabo debe existir una especie susceptible a infectarse por ambos virus. Los virus de la gripe humanos tienen preferencia por los ácidos siálicos unidos a la galactosa por un enlace alfa-2-6 ¹⁰. Se cree que esta es la base bioquímica por la cual los virus no pueden traspasar las barreras inter-especies, ya que los virus aviares tienen preferencia por los ácidos siálicos unidos a la galactosa por un enlace alfa 2-3.

En la faringe de los cerdos existen ambos tipos de enlaces entre el ácido siálico y la galactosa por lo que son susceptibles a padecer infecciones por linajes aviares y humanos favoreciendo la aparición de nuevas cepas virales potencialmente pandémicas por reordenamiento entre virus aviares y humanos ²⁶ (Figura 3). Esto explicaría el hecho de que las pandemias a menudo surgen en áreas geográficas donde los humanos, cerdos y aves acuáticas conviven de forma próxima ²⁷, ²⁸.

Figura 3: Reordenamiento genético

– Salto directo de barrera de especie: Se trata de una trasmisión directa a humanos sin intermediarios. La mayor parte de estas transmisiones inter-especie no prosperan y simplemente causan brotes ocasionales aislados ²⁹, ³⁰, ³¹, ³².

3. El origen del nuevo virus pandémico H1N1 (2009)

En el caso del virus responsable de la pandemia del 2009, el análisis filogenético de los diferentes fragmentos genómicos del virus mostró un cuádruple origen, aviar, humano y porcino (Figura 4-5) ³³, ³⁴, ³⁵. A su vez, el origen porcino de otros 5 fragmentos genéticos que codifican las proteínas HA, NP y NS1 y NS2 provienen del linaje porcino norteamericano clásico. Los genes codificantes de NA, M1 y M2 provenían del linaje porcino eurasiático. Mientras que PB2 y PA provienen del linaje aviar “norteamericano” y el gen que codifica PB1 se originó a partir de virus estacionales humanos H3N2.

Figura 4: Génesis del virus de la gripe A (H1N1) pandémico. ³⁶

Figura 5. Esquema de la reconstrucción de eventos de reasociación génica que dieron lugar a la aparición del virus pandémico. Las líneas coloreadas indican las vías de transmisión de los genes virales. Los 8 segmentos virales están representados como líneas paralelas en orden decreciente de tamaño. Las fechas indicadas con líneas verticales punteadas indican el momento promedio de divergencia de los genes del virus pandémico respecto a los correspondientes linajes virales. ³⁴.

4. Replicación del virus de la gripe

El virus de la gripe infecta principalmente células epiteliales del tracto respiratorio superior e inferior. Las partículas virales se adhieren a su receptor celular, el ácido siálico, que es reconocido por la HA de la cubierta o membrana de envoltura. ¹⁰. La unión al receptor inicia la absorción de los virus a través de la endocitosis mediada por receptores. Se forma así una vesícula que se fusiona con los compartimentos intracelulares denominados endosomas ³⁷, ³⁸.

Gracias al bajo pH del interior de los endosomas, mantenido por medio de las bombas de protones del interior de la membrana, se desencadena la reacción de fusión entre la envoltura viral y la membrana endosomal ³⁹. El bajo pH de las vesículas llega al interior del virión por el canal iónico formado por la proteína M2 ⁷ lo que genera una desestabilización de la interacción de la RNPs con la proteína M1 y un cambio conformacional de la hemaglutinina ⁴⁰ , ³⁹ que favorece a la fusión de la envuelta del virus con la membrana endosomal ⁴¹ y la formación de un poro de fusión a través del cual el material genético entra en el interior de la célula. Las RNPs se liberan al citoplasma donde tienen lugar los procesos de transcripción y replicación del genoma viral (Figura 6).

Los complejos RNP se transportan al núcleo llevando consigo la transcriptasa formada por PB1, PB2 y PA ⁴². La transcriptasa mediante un proceso denominado “hurto de cabeza”, escinde pequeñas regiones de la caperuza del ARNm celular que utiliza como cebos para la síntesis de ARNm viral. Este ARNm viral se transporta al citosol donde tendrá lugar la traducción a proteínas.

Figura 6: Esquema del ciclo de infección del virus de la gripe.

El virus utiliza toda la maquinaria de la célula para la síntesis y procesamiento de sus proteínas. La HA y la NA, a través del aparato de Golgi, llegan a la membrana plasmática. Las NP y los componentes de la ARN-polimerasa interaccionan con el ARN viral sintetizado para formar las RNPs que interaccionan con la M1 que las recubre. Las RNPs viajan a la membrana plasmática celular a través de microfilamentos de actina ⁴³ y llegan a regiones ricas en colesterol denominadas lipid raft ⁴⁴ en las que se encuentran ancladas la NA y HA. Las partículas virales salen de célula por gemación o budding, adquiriendo la envuelta lipídica en la que se encontraban ancladas las glicoproteínas. Para finalizar, la NA hidroliza los receptores que el virus ha arrastrado de la membrana celular, lo cual evita que se agreguen y permite su dispersión por la vía respiratoria ⁴⁵.

Referencias

1. Cox NJ, Subbarao K. Influenza. Lancet. Oct 9 1999;354(9186):1277-1282.

2. Cox NJ ZT. Influenza viruses. Manual of clinical Microbiology. ASM Press. 2003:1360-1367.

3. Hirst GK. The Agglutination of Red Cells by Allantoic Fluid of Chick Embryos Infected with Influenza Virus. Science. Jul 4 1941;94(2427):22-23.

4. Horne RW, Waterson AP, Wildy P, Farnham AE. The structure and composition of the myxoviruses. I. Electron microscope studies of the structure of myxovirus particles by negative staining techniques. Virology. May 1960;11:79-98.

5. Hoyle L, Horne RW, Waterson AP. The structure and composition of the myxoviruses. II. Components released from the influenza virus particle by ether. Virology. Apr 1961;13:448-459.

6. Richardson JC, Akkina RK. NS2 protein of influenza virus is found in purified virus and phosphorylated in infected cells. Arch Virol. 1991;116(1-4):69-80.

7. Pinto LH, Holsinger LJ, Lamb RA. Influenza virus M2 protein has ion channel activity. Cell. May 1 1992;69(3):517-528.

8. Colman PM, Varghese JN, Laver WG. Structure of the catalytic and antigenic sites in influenza virus neuraminidase. Nature. May 5-11 1983;303(5912):41-44.

9. Varghese JN, Laver WG, Colman PM. Structure of the influenza virus glycoprotein antigen neuraminidase at 2.9 A resolution. Nature. May 5-11 1983;303(5912):35-40.

10. Weis W, Brown JH, Cusack S, Paulson JC, Skehel JJ, Wiley DC. Structure of the influenza virus haemagglutinin complexed with its receptor, sialic acid. Nature. Jun 2 1988;333(6172):426-431.

11. Harris A, Cardone G, Winkler DC, et al. Influenza virus pleiomorphy characterized by cryoelectron tomography. Proc Natl Acad Sci U S A. Dec 12 2006;103(50):19123-19127.

12. Reina J. [Factors affecting the virulence and pathogenicity of avian and human viral strains (influenza virus type A)]. Enferm Infecc Microbiol Clin. Aug-Sep 2002;20(7):346-353.

13. Hsu MT, Parvin JD, Gupta S, Krystal M, Palese P. Genomic RNAs of influenza viruses are held in a circular conformation in virions and in infected cells by a terminal panhandle. Proc Natl Acad Sci U S A. Nov 1987;84(22):8140-8144.

14. Klumpp K, Ruigrok RW, Baudin F. Roles of the influenza virus polymerase and nucleoprotein in forming a functional RNP structure. Embo J. Mar 17 1997;16(6):1248-1257.

15. Lamb RA, Lai CJ, Choppin PW. Sequences of mRNAs derived from genome RNA segment 7 of influenza virus: colinear and interrupted mRNAs code for overlapping proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. Jul 1981;78(7):4170-4174.

16. Chen W, Calvo PA, Malide D, et al. A novel influenza A virus mitochondrial protein that induces cell death. Nat Med. Dec 2001;7(12):1306-1312.

17. Zamarin D, Garcia-Sastre A, Xiao X, Wang R, Palese P. Influenza virus PB1-F2 protein induces cell death through mitochondrial ANT3 and VDAC1. PLoS Pathog. Sep 2005;1(1):e4.

18. Spackman E. A brief introduction to the avian influenza virus. Methods Mol Biol. 2008;436:1-6.

19. Nicholson KG, Wood JM, Zambon M. Influenza. Lancet. Nov 22 2003;362(9397):1733-1745.

20. Pumarola T MM, Jiménez de Anta MT. Gripe. Impacto en la salud pública. Variaciones antigénicas del virus de la influenza como determinante epidemiológico clave. Vacunas 2002;3:1-4

21. Steinhauer DA, Skehel JJ. Genetics of influenza viruses. Annu Rev Genet. 2002;36:305-332.

22. Webster RG, Laver WG, Air GM, Ward C, Gerhard W, van Wyke KL. The mechanism of antigenic drift in influenza viruses: analysis of Hong Kong (H3N2) variants with monoclonal antibodies to the hemagglutinin molecule. Ann N Y Acad Sci. 1980;354:142-161.

23. Webster RG, Bean WJ, Gorman OT, Chambers TM, Kawaoka Y. Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiol Rev. Mar 1992;56(1):152-179.

24. Juan García-García CR. Influenza, an existing public health problem

Salud pública Méx 2006;48 (3).

25. Ito T, Couceiro JN, Kelm S, et al. Molecular basis for the generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential. J Virol. Sep 1998;72(9):7367-7373.

26. Skehel JJ, Wiley DC. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 2000;69:531-569.

27. Suarez DL, Perdue ML, Cox N, et al. Comparisons of highly virulent H5N1 influenza A viruses isolated from humans and chickens from Hong Kong. J Virol. Aug 1998;72(8):6678-6688.

28. Yuen KY, Chan PK, Peiris M, et al. Clinical features and rapid viral diagnosis of human disease associated with avian influenza A H5N1 virus. Lancet. Feb 14 1998;351(9101):467-471.

29. Subbarao K, Klimov A, Katz J, et al. Characterization of an avian influenza A (H5N1) virus isolated from a child with a fatal respiratory illness. Science. Jan 16 1998;279(5349):393-396.

30. Peiris M, Yuen KY, Leung CW, et al. Human infection with influenza H9N2. Lancet. Sep 11 1999;354(9182):916-917.

31. Fouchier RA, Schneeberger PM, Rozendaal FW, et al. Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. Feb 3 2004;101(5):1356-1361.

32. Uyeki TM, Chong YH, Katz JM, et al. Lack of evidence for human-to-human transmission of avian influenza A (H9N2) viruses in Hong Kong, China 1999. Emerg Infect Dis. Feb 2002;8(2):154-159.

33. Garten RJ, Davis CT, Russell CA, et al. Antigenic and genetic characteristics of swine-origin 2009 A(H1N1) influenza viruses circulating in humans. Science. Jul 10 2009;325(5937):197-201.

34. Smith GJ, Vijaykrishna D, Bahl J, et al. Origins and evolutionary genomics of the 2009 swine-origin H1N1 influenza A epidemic. Nature. Jun 25 2009;459(7250):1122-1125.

35. Neumann G, Noda T, Kawaoka Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. Jun 18 2009;459(7249):931-939.

36. Vaque J. [Epidemiology of influenza A (H1N1) worldwide and in Spain]. Arch Bronconeumol. Mar;46 Suppl 2:3-12.

37. Smith AE, Helenius A. How viruses enter animal cells. Science. Apr 9 2004;304(5668):237-242.

38. Matlin KS, Reggio H, Helenius A, Simons K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. Dec 1981;91(3 Pt 1):601-613.

39. Stegmann T, Morselt HW, Scholma J, Wilschut J. Fusion of influenza virus in an intracellular acidic compartment measured by fluorescence dequenching. Biochim Biophys Acta. Nov 2 1987;904(1):165-170.

40. Stegmann T, Booy FP, Wilschut J. Effects of low pH on influenza virus. Activation and inactivation of the membrane fusion capacity of the hemagglutinin. J Biol Chem. Dec 25 1987;262(36):17744-17749.

41. Skehel JJ, Bizebard T, Bullough PA, et al. Membrane fusion by influenza hemagglutinin. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1995;60:573-580.

42. Lamb RaK, RM. Orthomyxoviridae: the viruses and their replication. Fields Virology. Lippincott Williams & Wilkins. 2001:1487-1531.

43. Avalos RT, Yu Z, Nayak DP. Association of influenza virus NP and M1 proteins with cellular cytoskeletal elements in influenza virus-infected cells. J Virol. Apr 1997;71(4):2947-2958.

44. Ali A, Avalos RT, Ponimaskin E, Nayak DP. Influenza virus assembly: effect of influenza virus glycoproteins on the membrane association of M1 protein. J Virol. Sep 2000;74(18):8709-8719.

45. Liu C, Eichelberger MC, Compans RW, Air GM. Influenza type A virus neuraminidase does not play a role in viral entry, replication, assembly, or budding. J Virol. Feb 1995;69(2):1099-1106.