Cambios en el sistema inmune de niños VIH+ en TARGA durante el proceso de reconstitución inmunológica

Publicado en 2003: Resino S, Abad ML, Navarro J, Bellón JM, Sánchez-Ramón S and Muñoz-Fernández MA. Stimulated proliferative responses in vertically HIV-infected children on HAART correlate with clinical and immunological markers. Clin Exp Immunol 2003, 131 (1): 130-137 (A; FI =2.34).

Con el objetivo de investigar el proceso de reconstitución inmune en niños VIH+ sometidos a TARGA, se diseñó un estudio longitudinal en 14 niños VIH+ con inmunodeficiencia moderada o severa durante 11.8±0.4 (9.9; 15.4) meses. Los resultados se analizaron en dos puntos del estudio, el primero cuando los niños tuvieron valores de células T CD4+ menores de un 25% e inician TARGA, y el segundo punto después de un año con TARGA, aplicando la prueba de los rangos de Wilcoxon para medidas repetidas. Las características inmunológicas, virológicas y clínicas a la entrada en el estudio (basal) de estos 14 niños VIH+ se describen en la Tabla 1.

Tabla 1. Resumen de las características individuales de los niños infectados por el VIH-1 a la entrada en el estudio.

Sexo Edad (años) CDC %CD4+ Log10 CV

(cp/ml)

Tratamiento antirretroviral
Varón 8,35 C 16,17 2,6 AZT+Indinavir+Abacavir
Varón 5,63 B 18,9 2,6 ddI+D4T+Nelfinavir
Varón 4,98 A 21,33 3,74 ddI+D4T+Nelfinavir
Hembra 10,32 C 20,8 3,57 ddI+D4T+Indinavir
Hembra 7,24 C 8,2 5,8 3TC+D4T+Nelfinavir
Hembra 16,43 B 12,8 3,53 3TC+D4T+Nelfinavir
Hembra 12,41 B 16 2,6 3TC+D4T+Nelfinavir
Hembra 16,33 A 18,27 3,41 3TC+D4T+Efavirenz
Hembra 11,05 A 19 3,92 3TC+D4T+Saquinavir+ Indinavir
Varón 7,85 C 2,1 5,12 3TC+D4T+Nelfinavir+ Efavirenz
Varón 4,05 C 17,47 4,11 3TC+D4T+Nevirapina+ Nelfinavir
Hembra 2,94 C 16,4 4,72 D4T+Abacavir+Nelfinavir
Varón 5,29 A 23 2,6 D4T+Nelfinavir+Saquinavir+Abacavir
Hembra 14 C 22,1 3,7 D4T+Nelfinavir+Efavirenz

CV: carga viral. CDC: Clasificación clínica del Centro para el control y prevención de enfermedades.

Los valores del porcentaje de células T CD4+ y CD8+ en sangre periférica, y CV plasmática de los niños infectados por el VIH en los dos puntos de estudio se describen en la Tabla 2. Se puede observar que la TARGA claramente produjo un aumento del número absoluto y porcentaje de células T CD4+, aunque las células T CD4+ y T CD8+ nunca alcanzaron los valores del grupo de niños control no VIH.

Tabla 2. Resumen de las características demográficas, inmunológicas y virológicas de los niños infectados por el VIH.

Grupo Control Entrada en el estudio Después de un año con TARGA p(a) p(b) p(c)
26 14 14
Edad (años) 10,2±0,8 9,1±1,2 10,1±1,2 0,481 0,958 <0,001
Subpoblaciones linfocitarias
% CD4+ 41,9±1,5 16,6±1,5 24,8±1,5 <0,001 <0,001 0,003
% CD8+ 22,1±0,9 54,3±3,3 48,0±2,7 <0,001 <0,001 0,018
CD4+/mm3 1415±164 423±60 720±88 <0,001 0,001 0,001
CD8+/mm3 702±74 1331±152 1344±143 0,001 0,001 0,873
Características virológicas
Log10 CV (cp/ml) 3,72±0,26 3,41±0,26 0,382
CV =<400 cp/ml 4 8 0,125

CV = carga viral; Valores expresados como media±e.e.m. (min., máx.). p: Diferencia entre los grupos (nivel de significación). (a): Diferencia entre los niños a la entrada del estudio y el grupo control no VIH. (b): Diferencia entre los niños infectados por el VIH después de un año de TARGA y el grupo control no VIH. (c): Diferencia entre los niños a la entrada del estudio y después de un año con TARGA.

Para medir el efecto de la TARGA en el timo de los niños VIH+, se compararon los valores de TREC a la entrada en el estudio y después de un año con TARGA (Tabla 3). En este análisis se observó que los niños VIH+ tuvieron valores de TRECs significativamente más bajos que el grupo Control, pero después de un año en TARGA aumentaron significativamente con respecto a los valores basales (p <0.05) (Tabla 3).

Durante el seguimiento se encontró una correlación positiva entre el incremento de TREC y el incremento de células T CD4+ en número absoluto (r=0,558; p=0,05) y en porcentaje (r=0,625; p=0,03). Sin embargo, no se encontró correlación entre los cambios en los valores de TREC con los cambios en los valores de células T CD3+, T CD8+ y CV.

En un segundo paso se analizaron las distintas subpoblaciones linfocitarias T CD4+ y T CD8+. Los porcentajes y número absoluto de células T CD4+ y CD8+ virgen (CD45RAhi+CD62L+) en el momento basal fueron más bajos que en el grupo-Control (Tabla 3). Tras un año en TARGA, el porcentaje y número absoluto de células T CD4+ y T CD8+ virgen aumentaron significativamente (p <0.05). El porcentaje células CD4+CD45RAhi+CD62L+, CD4+CD45RA+ y CD4+CD38+, y el número absoluto de CD8+CD45RA+ y CD8+CD45RAhi+CD62L+ alcanzaron valores similares al grupo-Control después de un año en TARGA (Tabla 3).

Además, en la Tabla 3 se puede observar que a la entrada en el estudio, los niños VIH tuvieron el porcentaje de células T CD4+ de memoria activadas (CD4+CD45RO+HLA-DR+) más alto, y el número absoluto de células T CD4+CD45RO+ más bajo que el grupo-Control (Tabla 3). También, se encontraron valores de porcentaje y número absoluto de células T CD8+ de memoria activadas y memoria (CD8+CD45RO+CD38+ y CD8+CD45RO+) superior al grupo-Control (Tabla 3). Un año después en TARGA, los valores de porcentaje de CD8+CD45RO+, y CD8+CD45RO+CD38+, y el número absoluto de CD8+CD45RO+CD38+ disminuyeron significativamente con respecto a los valores basales (p <0.05), pero siempre fueron más altos que en el grupo control. Con el control de la replicación viral se consiguió bajar la activación del sistema inmune y la cantidad de células T CD8+ de memoria.

También se produjo un incremento significativo del número absoluto de células T CD4+ de memoria (CD4+CD45RO+) (p <0.05), aunque sin alcanzar los valores del grupo control (Tabla 3).

Tabla 3. Valores de TRECs, porcentaje y número absoluto de células T CD4+ y T CD8+ en niños infectados por el VIH con TARGA.

Grupo Control Entrada en el estudio Después de un año con TARGA p(a) p(b) p(c)
TRECs 19025±3208 6101±1644 9535±1374 0,002 0,014 0,035
Células T virgen (%)
CD4+CD45RAhi+CD62L+ 59,1±2,9 42,9±4,6 60,2±2,7 0,007 0,782 0,007
CD4+CD45RA+ 60,5±2,6 44,4±4,5 60,6±2,7 0,005 0,983 0,007
CD4+CD38+ 75,4±2,4 72,7±2,4 80,2±2,1 0,440 0,135 0,054
CD8+CD45RAhi+ CD62L+ 70,2±2,2 24,2±4,4 35,6±4,6 0,000 0,000 0,003
CD8+CD45RA+ 84,5±1,5 48,4±4,9 58,2±4,2 < 0,001 < 0,001 0,033
Células T virgen (cels/mm3)
CD4+CD45RAhi+CD62L+ 900±133 201±37 447±64 < 0,001 0,005 < 0,001
CD4+CD45RA+ 914,5±132,9 208,4±38,5 450,9±64,2 < 0,001 0,011 < 0,001
CD4+CD38+ 1118±154 315±48 581±73 < 0,001 0,004 0,001
CD8+CD45RAhi+CD62L+ 510±60 264±31 442±55 < 0,001 0,411 0,002
CD8+CD45RA+ 603,1±67,5 619,1±93,5 776,8±97,8 0,888 0,140 0,014
Células T memoria (%)
CD4+CD45RO+HLA-DR+ 2,7±0,3 10,1±2,8 5,7±0,8 0,020 0,002 0,181
CD4+CD45RO+ 39,8±3,2 51,1±6,1 43,2±4,9 0,117 0,579 0,158
CD8+CD45RO+CD38+ 12,1±1,5 46,3±4,7 35,7±4,6 < 0,001 < 0,001 0,022
CD8+CD45RO+ 30,2±1,9 68,7±4,6 61,6±4,7 < 0,001 < 0,001 0,008
Células T memoria (cels/mm3)
CD4+CD45RO+HLA-DR+ 33±3 30±5 39±7 0,650 0,376 0,196
CD4+CD45RO+ 539±81 182±20 285±34 < 0,001 0,008 0,001
CD8+CD45RO+CD38+ 85±13 652±105 468±74 < 0,001 < 0,001 0,025
CD8+CD45RO+ 200±22 952±139 837±112 < 0,001 < 0,001 0,181

Grupo control: niños de la misma edad, no VIH. Valores expresados como media±e.e.m.; p: Diferencia entre grupos (nivel de significación). (a): Diferencia entre los niños a la entrada en el estudio y el grupo control de niños no VIH. (b): Diferencia entre los niños infectados por el VIH después de un año de TARGA y el grupo control no VIH. (c): Diferencia entre los valores a la entrada en el estudio y después de un año con TARGA.

Con el fin de analizar si esta recuperación inmune cuantitativa se veía reflejada en una recuperación inmune también cualitativa (recuperación de la actividad funcional) se realizaron cultivos de CMSP sometidas a diversos estímulos mitogénicos. Los niños VIH tuvieron LPR a PHA y anti-CD3+anti-CD28 similar al grupo-Control tanto a la entrada en el estudio y un año después. Sin embargo, la LPR a PWM a la entrada en el estudio fue más baja que el grupo-Control, pero se recuperó después de un año en TARGA hasta valores similares al grupo-Control (Tabla 4).

Cuando se analizó la producción de citocinas por las CMSP estimuladas con PHA se observó diferente resultado. A la entrada en el estudio, la producción de IL-5, TNF-a e IFN-g fue más baja en el grupo VIH+ que en el grupo-Control. Un año después en TARGA, la producción de TNF-a e IFN-g se recupero hasta los valores del grupo-Control, siendo el incremento estadísticamente significativo (p <0.01) (Tabla 4). Sin embargo, aunque se observó un aumento de IL-5, el incremento no fue estadísticamente significativo y estos valores siempre estuvieron por debajo del grupo-Control.

Tabla 4. Resumen de la proliferación y producción de citocinas por las CMSP de niños infectados por el VIH con TARGA

Grupo Control no VIH Entrada en el estudio Después de un año con TARGA p(a) p(b) p(c)
Estímulos mitogénicos (s.i.)
PHA 140±14 104±22 121±25 0,180 0,505 0,746
PWM 33±4 18±6 26±6 0,037 0,378 0,325
anti-CD3+anti-CD28 125±10 99±11 103±16 0,101 0,272 0,715
Producción de citocinas (pg/ml) a
IL-5 204±61 53±22 46±27 0,029 0,025 0,767
TNF-a 1729±324 586±240 1497±310 0,008 0,609 0,008
IFN-g 3323±593 1587±592 4429±1628 0,046 0,537 0,008

(a): Después de estimulación con PHA. Grupo control: niños de la misma edad no VIH. Valores expresados como media±e.e.m.; s.i.: índice de estimulación. PHA: Fitohemaglutinina; PWM: Pokeweed; p: Diferencia entre grupos (nivel de significación). (a): Diferencia entre los niños a la entrada en el estudio y el grupo control no VIH. (b): Diferencia entre los niños infectados después de un año con TARGA y el grupo control no VIH. (c): Diferencia entre los niños a la entrada en el estudio y después de un año con TARGA.

Se analizaron los cambios en los valores de TREC y subpoblaciones de células T en niños VIH+ respondedores y no respondedores a la TARGA (niños con CV =<400 copias/ml y CV >400 copias/ml). Se observaron diferencias estadísticamente significativamente solamente en las subpoblaciones de células T (Tabla 5). Hay un incremento de células T CD4+ virgen y disminución de células T CD4+ memoria, aunque no llego a ser estadísticamente significativo. Sin embargo, solo se encontraron diferencias significativas en el porcentaje de células T CD4+ y en el numero absoluto de células T CD4+CD45RA+CD62L+ y CD4+HLA-DRCD38+ (Tabla 5). No hubo diferencias en la producción de TREC.

Tabla 5. Resumen de los cambios en los valores de TREC, y porcentajes y numero absoluto de células T CD4+ en niños VIH después de 1 año en TARGA de acuerdo a la respuesta virológica.

Características CV =<400 copias/ml CV >400 copias/ml p
Nº niños 7 7
Edad (años) 1 (0.9; 1.0) 0.9 (0.8; 1.3) 0.710
TREC 4636 (-5022; 15719) 852 (376; 11610) 0.530
Células T CD4+ (%)
CD4+ 10.6 (3.5; 27.6) 3.7 (-2.5; 14.5) 0.026
CD4+CD45RA+CD62L+ 20.9 (3.3; 63.1) 6.5 (-10; 17.3) 0.073
CD4+CD45RO+ -6.3 (73.6; 1.9) -0.3 (-9.9; 8.70) 0.097
CD4+HLA-DRCD38+ 3.1 (–5.0; 52.8) -1.5 (-20.6; 6.1) 0.097
CD4+CD38+ 10.5 (-1.8; 38.5) 2.8 (-10.2; 13.1) 0.105
Células T CD4+/mm3
CD4+ 364 (62; 764) 109 (57; 518) 0.073
CD4+CD45RA+CD62L+ 392 (56; 600) 98 (12; 367) 0.026
CD4+CD45RO+ 144 (14; 265) 47 (35; 136) 0.053
CD4+HLA-DRCD38+ 325 (41; 694) 62 (-3.2; 378) 0.038
CD4+CD38+ 384 (38; 709) 88 (29; 431) 0.053

CV: carga viral. TREC: TCR rearrangement excision circles. Valores expresados como mediana (min., máx..). p: nivel de significación.

Para estudiar no sólo la respuesta celular sino también la respuesta humoral en estos 14 pacientes se analizaron los valores de inmunoglobulinas plasmáticas. Los niños VIH+ tuvieron valores de IgG, IgA, IgM, IgG1, IgG2, IgG3 plasmáticos mas altos que en el grupo control tanto a la entrada en el estudio como un año después (Tabla 6). Los valores de IgE e IgG4 de los niños no mostraron un cambio significativo durante el periodo de seguimiento y además fueron aproximadamente similares a los del grupo control. Sin embargo, los valores de IgG, IgG1, e IgG3 de los niños VIH+ descendieron después de un año en TARGA. Además, también hubo una disminución menos importante de IgA e IgG2 (p <0,1) (Tabla 6).

Tabla 6. Cuantificación de inmunoglobulinas y de las subclases de IgG en plasma de los niños VIH.

Grupo Control no VIH Entrada en el estudio Después de un año con TARGA p(a) p(b) p(c)
IgG(d) 237,9±20,9 1172,8±170,3 722,6±68,5 <0,001 <0,001 0,041
IgA(d) 29,1±4,9 174,9±34,7 131,3±31,9 0,001 0,009 0,086
IgM(d) 29,5±3,7 113,4±15,8 99,4±18,8 <0,001 0,003 0,344
IgE (f) 53,3±19,3 285,0±199,1 93,6±58,7 0,280 0,537 0,257
IgG1(e) 1688,6±243,4 9899,2±1338,6 6109,2±693,6 <0,001 <0,001 0,020
IgG2(e) 436,7±53,1 1012,2±142,3 869,5±109,1 0,002 0,003 0,073
IgG3(e) 141,7±9,4 1082,5±293,4 720,7±163,3 0,008 0,005 0,050
IgG4(e) 89,8±22,5 104,4±33,0 69,3±22,6 0,719 0,526 0,143

Grupo control: niños de la misma edad, no VIH. Valores expresados como media±e.e.m.; p: Diferencia entre grupos (nivel de significación). (a): Diferencia entre los niños a la entrada en el estudio y el grupo control de niños no VIH. (b): Diferencia entre los niños infectados por el VIH después de un año de TARGA y el grupo control no VIH. (c): Diferencia entre los valores a la entrada en el estudio y después de un año con TARGA. Unidades de medida: (d): mg/dL, (e): mg/L y (f): UI/mL.

Discusión de resultados

En niños VIH+ se ha observado una recuperación de las células T que tiene un origen principalmente tímico más que periférico, sobre todo en los individuos más jóvenes [1-3].

Los niños VIH+ a la entrada en el estudio tuvieron valores bajos de células T CD4+ y T CD8+ virgen posiblemente debido: a) preferencial destrucción de las células T virgen infectadas por el VIH durante la fase de precursor tímico [4, 5]; b) un defecto en la generación de nuevas células T como consecuencia de la atrofia tímica secundaria a la infección por el VIH [6]; c) al continuo cambio de células T virgen a memoria debido a la infección crónica por el VIH [6]. Sin embargo, en concordancia con los estudios previos, los 14 niños analizados después de un año en TARGA tuvieron valores similares de células T CD8+ virgen pero valores más bajos de células T CD4+ virgen que los niños del grupo control. Esto puede ser debido a que las células T CD4+ virgen podrían ser infectadas por el VIH durante la fase tímica y destruidas posteriormente o una vez en sangre periférica evolucionarían a células T de memoria (CD4+CD45RO+), probablemente favorecido por la estimulación crónica del virus, ya que en estos niños es más difícil conseguir CVi. Además, el VIH infecta y destruye a las células T CD4+CD45RO+ activadas [7].

En cuanto a las células T CD8+, la TARGA induce un aumento de células T CD8+ virgen y un descenso de células T CD8+ de memoria activadas (CD8+CD45RO+CD38+). Estos resultados pueden ser explicados porque el pool de células T CD8+ virgen a memoria se regulan de forma independiente, y cada pool tiene su propio nicho [8]. Entonces, las células T CD8+ virgen sobreviven largos periodos de tiempo, pero no se dividen, mientras las células T CD8+ de memoria sobreviven y proliferan gracias al reconocimiento antigénico [9]. Cuando en los niños VIH+ la función tímica es alta, las células T CD8+ virgen son producidas en gran número y migran a los órganos linfoides periféricos, aumentando el número de células T CD8+ virgen en sangre periférica. Cuando la producción tímica disminuye gradualmente con la edad, las células T CD8+ virgen aumentan su vida media, asegurando al organismo un número de células T CD8+ virgen aunque la producción tímica se haya detenido [10]. En este estudio también se observó una disminución de células T CD8+ de memoria después de la TARGA, aunque no se alcanzaron valores similares al grupo control. Esto podría indicar que un control incompleto de la replicación viral favorece la transformación de células T CD8+ virgen a memoria [11].

Sin embargo todavía hay controversia sobre los cambios en los valores de TREC durante la infección por el VIH. Estos cambios podrían ser debidos a alteraciones en la producción tímica o a cambios en la proporción de células T virgen frente a células T activadas/proliferativas en sangre periférica [12, 13]. Evidentemente, el paso de células T virgen a memoria esta disminuido después de TARGA. Estas células T virgen podrían acumularse liderando un incremento del número de TREC. Sin embargo, aunque las células T CD8+CD45RO+CD38+/mm3 disminuyen después de la TARGA, CD8+CD45RO+, CD8+CD57+ y CD8+CD28CD57+ /mm3 permanecen constantes.

Mientras los valores de TREC y células T CD4+ virgen aumentaron, cuando se analizaron los datos de forma global no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en los valores de TREC y células T CD4+ virgen entre los niños VIH+ respondedores y no respondedores a la TARGA, aunque en el caso de las células T CD4+ virgen el nivel de significación fue <0.01. Esta discrepancia puede ser debido al diferente efecto de la replicación viral en estos dos marcadores. Los TREC son moléculas de DNA que no se replican durante la mitosis y se diluyen con cada división celular [14] y por otro lado parte de las células T CD4+ virgen que se encuentran en sangre periférica podrían proceder de una expansión periférica [6]. La falta de diferencias entre respondedores y no respondedores a la TARGA podría indicar que la función tímica no se ha recuperado completamente en el grupo de los respondedores.

Por otro lado, en la infección por el VIH se produce un daño en la LPR frente a mitógenos antes de que tenga lugar la depleción de las células T CD4+ [15, 16]. Después de la TARGA, esta LPR se puede recuperar hasta valores normales, apoyando la idea de que es la replicación del VIH la causa de la disfunción inmune [17-19]. Sin embargo, en este estudio solo se encontró baja LPR frente a PWM en el momento basal, que se recupero después de un año en TARGA. La LPR a PHA y anti-CD3+anti-CD28 fue normal en los dos puntos de estudio. Esto pudo ser debido a que ya los niños estaban previamente tratados con tratamiento antirretroviral en monoterapia o combinada. Por otro lado, se encontró baja producción de citocinas en las CMSP de los niños VIH estimuladas con PHA a la entrada en el estudio, pero se recuperó hasta valores similares a los del grupo control tras un año en TARGA.

La función Th1 de las células T tiene una importancia vital en la inmunidad mediada por células frente al VIH y en la producción de ciertos isotipos de inmunoglobulinas [20]. En este estudio se encontró una disminución de valores plasmáticos de IgG, IgG1, e IgG3 después de un año en TARGA, aunque no se alcanzaron valores similares al del grupo control. Estudios previos in vitro han propuesto varios mecanismos para explicar la hipergammaglobulinemia y activación de las células B en la infección por el VIH, tales como la estimulación por el virus, proteínas virales, IL-6 o TNF-a ligado a la membrana de las células T CD4+ [21-23]. En pacientes VIH+ se han encontrado valores de inmunoglobulinas altos y se han utilizado como marcador pronóstico de progresión a sida y supervivencia [24, 25]. La hipergammaglobulinemia de los pacientes VIH es normalmente policlonal y abarca a un gran numero de isotipos [26]. En estudios previos también se ha observado disminución de IgA en los pacientes con una buena respuesta al tratamiento antirretroviral y CVi [27]. También se han descrito valores elevados de IgE en la infección por el VIH [28-30], y se han relacionado con una producción baja de IFN-g, inmunosupresión (CD4+ <25%), CV elevada, y síntomas clínicos severos [31, 32]. En este estudio, los niños VIH tuvieron baja producción de IFN-g y una tendencia (no estadísticamente significativa) a tener valores de IgE altos en el momento basal del estudio. Sin embargo, después de un año en TARGA los niños VIH+ aumentaron la producción de IFN-g en los cultivos de CMSP y disminuyó la concentración de IgE en plasma.

Conclusión

La restauración de células T CD4+ y T CD8+ inducida por la TARGA en los niños VIH parece ser consecuencia de la reconstitución de células T virgen de origen tímico y a la disminución de la activación crónica del sistema inmune.

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